利用rapd和issr分子标记进行西瓜杂交种种子纯度的快速鉴定(附件)
本文是以西瓜1号及其父本母本、西瓜2号及其父本母本、西瓜3号及其父本母本和西瓜4号及其父本母本为研究对象，通过使用RAPD和ISSR两种分子标记技术来对西瓜杂种和它的父母本的基因组DNA进行了研究，来鉴定西瓜杂交种的遗传纯度。西瓜1号纯度检测中，RAPD母本特异引物为RP95，特异条带为RP95800 和RP95450；ISSR母本特异引物为CI07，母本特异条带为CI07650。西瓜2号纯度检测中，RAPD母本特异引物为RP81和RP82，特异条带为RP81800 和RP82450；父本特异引物为CR08和CR36，特异条带为CR08300、CR361800 和CR361000为其母本特异性表达条带；ISSR父本特异引物为CI05，CI05700和CI05550为特异表达条带。西瓜3号纯度检测中，发现1个RAPD母本特异引物及特异标记 1个、9个RAPD父本特异引物及特异标记12个和1个ISSR父本特异引物及特异标记3个。西瓜4号纯度检测中，1个RAPD母本特异引物及特异标记1个、11个RAPD父本特异引物及特异标记 16个、1个同时具有母本特异和父本特异的RAPD引物及其共显性标记及特异标记 4个，4个ISSR父本特异引物及特异标记6个。关键词 西瓜，杂交种，遗传纯度，分子标记
目 录
1引言 1
1.1种子纯度常用检测方法 1
1.2 分子标记在种子纯度检测上的应用 1
1.3本研究的目的和意义 2
2材料与方法 3
2.1植物材料 3
2.2基因组DNA的提取 3
2.3 RAPD反应 3
2.4 ISSR反应 3
3结果与分析 4
3.1西瓜杂交种的RAPD分子标记分析 4
3.1.1西瓜1号杂交种的RAPD分子标记分析 4
3.1.2西瓜2号杂交种的RAPD分子标记分析 5
3.1.3西瓜3号杂交种的RAPD分子标记分析 6
3.1.4西瓜4号杂交种的RAPD分子标记分析 8
3.2西瓜杂交种的ISSR分子标记分析 11
3.2.1西瓜1号杂交种的ISSR分子标记分析 11
3.2.2西瓜2号 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
杂交种的ISSR分子标记分析 12
3.2.3西瓜3号杂交种的ISSR分子标记分析 13
3.2.4西瓜4号杂交种的ISSR分子标记分析 13
4 讨论 15
结论 17
致谢 18
参考文献 19
1引言
西瓜属于葫芦科作物，是生长在热带和温带地区的重要的作物。西瓜蕴含有丰富的铁、钙、钾以及维生素C和维生素A等营养元素，并且西瓜质地、口感和果肉的香味都受消费者的喜欢[1]。西瓜发挥着重要作用在我国种植业和促进农民致富增收中作为重要的经济作物[2]。所以西瓜种子的质量十分重要，而西瓜种子纯度是评论种子质量非常重要的指标。只有纯度高，西瓜的各种优良特性才会表现出来，才会给种植户带来高质量高产量高收益，种子公司才会更好发展。因此如何快速准确地在种子生产前鉴定种子纯度是非常必要的。
1.1种子纯度常用检测方法
现在种子生产和经营部门主要是靠田间种植的方法[3] 来进行西瓜种子纯度的检测。作为传统的种子纯度检测方法，田间生长试验（GOT）受限于人力、时间、土地和环境因素[4]。并且西瓜发生基因变异的概率比较小，因此有些方法可能无法准确地检测出西瓜种子的纯度。另外该方法主要依靠鉴定者的观测经验，所以同样制约鉴定的可靠性。传统的种子鉴定在西瓜种子检测上的应用有许多种方式，主要采用种子形态鉴定，还有苗期标记形态鉴定，或者子房形态鉴定以及果实形态鉴定等，这些都是目前西瓜品种通过形态检验来鉴定种子纯度的主要方法。
颜启传[5] 、李名旺[6]通过物理、化学及生理等鉴定方法检测种子纯度，大大缩短了种子鉴定的时间。其中，迅速发展的生化技术不断被广泛应用于种子纯度鉴定上，包括蛋白质和同工酶电泳，色谱法、毛细管电泳及免疫反应等。陆大伟[7]通过研究发现生化鉴定法是在分子水平上辨别不同遗传特性的种子。因为不受外界条件的影响所以鉴定结果准确性高。
1.2 分子标记在种子纯度检测上的应用
目前，在西瓜种子纯度鉴定中主要应用的DNA分子标记技术，有扩增片段长度多态性的AFLP技术分子标记技术、随即扩增多态性的RAPD分子标记技术、简单重复序列的SSR分子标记技术、简单序列重复间序列的ISSR分子标记技术和相关序列扩增多态性的SRAP分子标记技术等[8]。
车克鹏等[9]利用AFLP分子标记技术对30个西瓜品种进行研究并且建立了DNA指纹图谱，来有效地区分不同西瓜品种。刘文革等[10] 应用AFLP分子标记技术分析了西瓜二倍体及同源多倍体的遗传差异，结果显示大部分引物组合扩增出的倍性不同西瓜之间的AFLP谱带没有明显差别，说明倍性不同的西瓜间多态性很低。前人分析结果表明西瓜品种之间同源性高，遗传基础小，品种亲缘关系比较近[1112]。
刘富中等［13］通过利用RAPD标记技术从80个随机引物中筛选出5个可以进行3个甜瓜杂交种纯度鉴定的引物；欧阳新星等［14］、王鸣刚等［15］通过利用RAPD标记技术对于西瓜种子纯度鉴定进行了研究；张红等［16］利用RAPD、SSR标记技术对甜瓜种子进行纯度鉴定方面研究，分析发现SSR标记更适合用于甜瓜杂交种纯度的快速鉴定，结果显示，在其他条件适合和引物正确的情况下，RAPD技术被用在西瓜杂交种纯度的早期鉴定上是完全可以的。闫鹏等[17]选用100条随机引物通过对西瓜甜瓜杂种一代及其亲本的种子进行RAPD分析。结果表明，在100条引物中筛选出来了4条有特征条带的引物能被用于进行西瓜杂交种的纯度鉴定。西瓜杂交种Fijihikari的纯度被日本的Hashizume等[18]用RAPD分子标记技术鉴定出来了。
艾呈祥等[19]通过SSR标记成功鉴别真假杂种，田雷等[20]建立了对SSR分子标记检测西瓜种子品种纯度适用的反应体系。这些试验结果说明，SSR分子标记检测技术体系可以在实验室内对西瓜杂交种品种纯度进行快速鉴定。
SRAP由LI等[21]于2000年发明的一种以PCR技术为基础的分子标记技术,采用一对引物对开放阅读框进行扩增。因为SRAP技术简单、快速、方便，不需预知物种的序列信息，因此在近年来在进行植物遗传多样性分析、基因连锁标记寻找及基因定位、种质鉴定和比较基因组学研究等方面得到广泛应用。
1.3本研究的目的和意义
目 录
1引言 1
1.1种子纯度常用检测方法 1
1.2 分子标记在种子纯度检测上的应用 1
1.3本研究的目的和意义 2
2材料与方法 3
2.1植物材料 3
2.2基因组DNA的提取 3
2.3 RAPD反应 3
2.4 ISSR反应 3
3结果与分析 4
3.1西瓜杂交种的RAPD分子标记分析 4
3.1.1西瓜1号杂交种的RAPD分子标记分析 4
3.1.2西瓜2号杂交种的RAPD分子标记分析 5
3.1.3西瓜3号杂交种的RAPD分子标记分析 6
3.1.4西瓜4号杂交种的RAPD分子标记分析 8
3.2西瓜杂交种的ISSR分子标记分析 11
3.2.1西瓜1号杂交种的ISSR分子标记分析 11
3.2.2西瓜2号 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
杂交种的ISSR分子标记分析 12
3.2.3西瓜3号杂交种的ISSR分子标记分析 13
3.2.4西瓜4号杂交种的ISSR分子标记分析 13
4 讨论 15
结论 17
致谢 18
参考文献 19
1引言
西瓜属于葫芦科作物，是生长在热带和温带地区的重要的作物。西瓜蕴含有丰富的铁、钙、钾以及维生素C和维生素A等营养元素，并且西瓜质地、口感和果肉的香味都受消费者的喜欢[1]。西瓜发挥着重要作用在我国种植业和促进农民致富增收中作为重要的经济作物[2]。所以西瓜种子的质量十分重要，而西瓜种子纯度是评论种子质量非常重要的指标。只有纯度高，西瓜的各种优良特性才会表现出来，才会给种植户带来高质量高产量高收益，种子公司才会更好发展。因此如何快速准确地在种子生产前鉴定种子纯度是非常必要的。
1.1种子纯度常用检测方法
现在种子生产和经营部门主要是靠田间种植的方法[3] 来进行西瓜种子纯度的检测。作为传统的种子纯度检测方法，田间生长试验（GOT）受限于人力、时间、土地和环境因素[4]。并且西瓜发生基因变异的概率比较小，因此有些方法可能无法准确地检测出西瓜种子的纯度。另外该方法主要依靠鉴定者的观测经验，所以同样制约鉴定的可靠性。传统的种子鉴定在西瓜种子检测上的应用有许多种方式，主要采用种子形态鉴定，还有苗期标记形态鉴定，或者子房形态鉴定以及果实形态鉴定等，这些都是目前西瓜品种通过形态检验来鉴定种子纯度的主要方法。
颜启传[5] 、李名旺[6]通过物理、化学及生理等鉴定方法检测种子纯度，大大缩短了种子鉴定的时间。其中，迅速发展的生化技术不断被广泛应用于种子纯度鉴定上，包括蛋白质和同工酶电泳，色谱法、毛细管电泳及免疫反应等。陆大伟[7]通过研究发现生化鉴定法是在分子水平上辨别不同遗传特性的种子。因为不受外界条件的影响所以鉴定结果准确性高。
1.2 分子标记在种子纯度检测上的应用
目前，在西瓜种子纯度鉴定中主要应用的DNA分子标记技术，有扩增片段长度多态性的AFLP技术分子标记技术、随即扩增多态性的RAPD分子标记技术、简单重复序列的SSR分子标记技术、简单序列重复间序列的ISSR分子标记技术和相关序列扩增多态性的SRAP分子标记技术等[8]。
车克鹏等[9]利用AFLP分子标记技术对30个西瓜品种进行研究并且建立了DNA指纹图谱，来有效地区分不同西瓜品种。刘文革等[10] 应用AFLP分子标记技术分析了西瓜二倍体及同源多倍体的遗传差异，结果显示大部分引物组合扩增出的倍性不同西瓜之间的AFLP谱带没有明显差别，说明倍性不同的西瓜间多态性很低。前人分析结果表明西瓜品种之间同源性高，遗传基础小，品种亲缘关系比较近[1112]。
刘富中等［13］通过利用RAPD标记技术从80个随机引物中筛选出5个可以进行3个甜瓜杂交种纯度鉴定的引物；欧阳新星等［14］、王鸣刚等［15］通过利用RAPD标记技术对于西瓜种子纯度鉴定进行了研究；张红等［16］利用RAPD、SSR标记技术对甜瓜种子进行纯度鉴定方面研究，分析发现SSR标记更适合用于甜瓜杂交种纯度的快速鉴定，结果显示，在其他条件适合和引物正确的情况下，RAPD技术被用在西瓜杂交种纯度的早期鉴定上是完全可以的。闫鹏等[17]选用100条随机引物通过对西瓜甜瓜杂种一代及其亲本的种子进行RAPD分析。结果表明，在100条引物中筛选出来了4条有特征条带的引物能被用于进行西瓜杂交种的纯度鉴定。西瓜杂交种Fijihikari的纯度被日本的Hashizume等[18]用RAPD分子标记技术鉴定出来了。
艾呈祥等[19]通过SSR标记成功鉴别真假杂种，田雷等[20]建立了对SSR分子标记检测西瓜种子品种纯度适用的反应体系。这些试验结果说明，SSR分子标记检测技术体系可以在实验室内对西瓜杂交种品种纯度进行快速鉴定。
SRAP由LI等[21]于2000年发明的一种以PCR技术为基础的分子标记技术,采用一对引物对开放阅读框进行扩增。因为SRAP技术简单、快速、方便，不需预知物种的序列信息，因此在近年来在进行植物遗传多样性分析、基因连锁标记寻找及基因定位、种质鉴定和比较基因组学研究等方面得到广泛应用。
1.3本研究的目的和意义
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