黄瓜csexpb1基因的克隆与载体构建
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1 植物材料培养及处理 3
1.2酶与分子实验化学试剂3
1.3菌株、质粒3
1.4仪器、试剂和耗材3
1.5 总RNA提取及纯化3
1.6 cDNA第一链的合成4
1.7 CsEXPb1基因的克隆4
1.8 表达载体构建6
2 结果与分析6
2.1 CsEXPb1基因的克隆8
2.2 黄瓜CsEXPb1正反义表达载体的构建8
3 讨论 8
致谢10
参考文献11
黄瓜CsEXPb1基因的克隆与载体构建
已知Expansin是作用于植物细胞壁，引起细胞壁松弛从而促进细胞生长与分裂的一类蛋白。本研究根据黄瓜基因组数据库中Csa5M561760.1基因编码区序列为模板，利用 Premier 5.0软件设计引物，筛选并采用单基因克隆的方法从黄瓜叶片中克隆一个扩张素蛋白（βexpansin）基因CsEXPb1，获得一段长度为942 bp的片段。通过将目的基因片段及重组质粒双酶切的方法，构建了以CaMV35S为启动子，以CaMV35S和NOS为终止子，以GUS基因作为报告基因，NPTⅡ基因作为选择标记基因的CsEXPb1正反义植物表达载体PLP100CsEXPb1。
引言
植物细胞的生长与细胞壁结构密切相关，细胞壁必须能承受住细胞内部膨胀的压力，同时保持延伸的能力，从而保证细胞能自由生长（傅丰庆，2008）。Cosgrove在1989年发现了一种可以调节细胞壁扩展的蛋白分子，并将之称为扩张素。1992 年，McQueenMason 从黄瓜中分离纯化出一种膨大素蛋白，并发现该蛋白可以调节幼苗下胚轴的伸长，第一次将之命名为expansin扩张蛋白（McQueenMason et al.，1992）。
Expansin是一种细胞壁蛋白，通过弱化细胞壁多糖（如纤维素、纤维素微纤丝等）之间的非共价键导致多糖复合物滑动，从而引起膨压驱动
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
下的细胞壁的伸展（McQueen Marson & Cosgrove，1994；McQueen Marson，1995；Li & Cosgrove，2001；孙丽2013）。植物中的EXP基因可归为4个子家族：αexpansin（EXPA），βexpansin（EXPB），expansinlikeA（EXLA）以及expansinlikeB（EXLB）（Kende et al.，2004）。目前对αexpansin及βexpansin研究的比较透彻，两种扩张蛋白主要分别存在双子叶和单子叶禾本科中（McQueenMason & Rochange ，1999）。扩张蛋白存在于植物细胞壁中，通过促进细胞伸展参与到多种生理活动中，如：叶片伸展、果实发育、根毛发生、花粉管生长等（陈苏等，2003）。烟草中expansin基因NtEXPA1 和 NtEXPA4调节细胞的分裂和生长，其中NtEXPA1在生长中叶片、顶芽及花中大量表达，超表达NtEXPA1促进叶片和茎的生长（Kuluev B.R et al.，2014）。Expansin促进果实的成熟与软化：梨PcExp1在果实发育膨胀开始到软化时期的表达量一直增加（Wu et al.，2001）；过表达番茄LeExp1的果实在青果成熟阶段前即开始软化，且比对照果实更软（Brummell et al.，1999）。Expansin能够影响植物根系发育：大豆中根特异性βexpansin基因GmEXPB2能促进根系细胞分裂和生长（Guo et al.，2011）。Expansin促进伸长区生长：拟南芥中AtEXP10基因的表达影响叶片生长和花梗脱落（Cho et al.，2000）。Muller等（2007）发现玉米中33种expansin基因中19个是优先表达于叶伸长区，并负责细胞分裂、叶片最大化伸展和细胞壁的分化。Expansin 对花粉管的作用：有研究证明βexpansin家族中包括一些花粉过敏原蛋白，表明βexpansin有助于花粉管侵入柱头和花柱（Cosgrove et al.，1997）。玉米花粉中βexpansin 基因Zeam1也有促进花粉管进入花柱的作用（Li et al., 2003）。Valdivia等（2007）发现在花粉管发育过程中，β7expansin可能参与松弛柱头与花柱的细胞壁，促进花粉管的延伸。
为研究Expansin蛋白在黄瓜中的作用，本文在Li等（2014）黄瓜单性结实转录组学研究基础之上，克隆了Csa5M561760.1，NCBI数据库中注释为PREDICTED: probable calciumbinding protein CML25like [Cucumis sativus]，表明该蛋白属于CML蛋白家族，并将之命名为CsEXPb1。通过对CsEXPb1的基因克隆及载体构建，为黄瓜遗传转化的建立做好准备。
1 材料与方法
1.1 植物材料培养及处理
供试材料‘长春密刺’由本实验室繁种与保存，种植于大学江浦园艺农场。取幼嫩叶片，放入液氮中，储存于70℃冰箱保存备用。
1.2 酶与分子实验化学试剂
限制性内切酶Pst I、 XbaⅠ、T4 DNA Ligase、琼脂糖凝胶回收试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂购自大连宝生物工程有限公司，PCR引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
1.3 菌株、质粒
大肠杆菌菌株E.coli DH5(，由本实验室保存。植物表达载体PLP 35S购自拟南芥生物资源中心（http://abrc.osu.edu/），载体上携带标记基因NPTII（卡那霉素抗性基因）、GUS报告基因、CaMV35S启动子。
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