茶树精胺合成酶基因cdna全长的克隆与表达分析
摘要：为探究精胺合成酶（spermine synthase，SPMS）与茶树耐寒性关系，以茶树（Camellia sinensis）品种‘迎霜’为试验材料，利用简并引物的PCR扩增技术结合5′/3′RACE方法，获得低温胁迫相关的CsSPMS片段cDNA全长序列（GenBank登录号为KJ580429）。该序列全长1 374 bp，包含1 113 bp 的完整开放阅读框（ORF），编码371个氨基酸，预测分子量41.28 kD；构建亚细胞定位载体pJIT166-GFP/SPMS，亚细胞定位结果显示CsSPMS定位在细胞核上。荧光定量PCR分析表明CsSPMS在根、茎、叶、芽、花和果中都有表达，在根、茎中表达量较高；低温胁迫处理下不同组织CsSPMS基因的表达量，在叶片中处理2 h达到峰值，而在根中处理12 h达到高峰。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1.材料与方法4
1.1供试的茶树 5
1.2保守片段隆 5
1.3RACE扩增基因全长5
1.4序列分析5
1.5 SPMS蛋白的亚位6
1.6定量PCR分析 6
2. 结果与分析6
2.1茶树SPMS基因cDNA克隆 6
2.2茶树SPMS的氨基酸序列分析 7
2.3 CsSPMS编码蛋白的亚细胞定位7
2.4 CsSPMS在不同组织中的表达9
2.5 CsSPMS在低温胁迫下不同组织中的表达 9
3 讨论 10
致谢11
参考文献12
茶树精胺合成酶基因cDNA全长的克隆与表达分析
引言
引言
低温是限制农作物生长和地理分布的重要的非生物胁迫因子。如何提高茶树抗寒性，一直是茶叶生产与理论研究上迫切需要解决的问题。研究与了解茶树对低温的抗逆机制，有针对性地发掘相关抗性基因并加以利用，对茶树抗逆育种有非常重要的意义。
多胺可通过氨丙基转移酶参与植物多种生理代谢调节过程，尤其在提高植物抵抗逆境胁迫
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
中起到了重要作用。多胺作为一种与植物抗逆性有关的物质，能够缓解植物所受到的伤害。近年来的研究表明多胺作为抗性物质或信号传导物质参与小麦、拟南芥等抵御低温胁迫。研究发现，腐氨酸可以作为对番茄叶片冷胁迫的响应物质。同时，腐氨酸合酶缺失型拟南芥抗低温胁迫的能力明显下降。外源亚精胺和精胺可以提高冷胁迫香蕉叶中过氧化物酶的活性，提高香蕉的抗寒能力。亚精胺在抵御黄瓜低温胁迫中也起到了重要作用。
拟南芥和水稻中多胺生物合成路径已经基本探明有两条合成腐胺的途径，腐胺作为合成过程中最初的一种多胺在特定酶的作用下不断地添加氨丙基形成亚精胺和精胺，与此同时，甲硫氨酸脱去羧基也能形成亚精胺和精胺。从腐胺到精胺的生物合成，是经过两个合成酶—亚精胺合成酶和精胺合成酶的催化。SPDS催化腐胺生成亚精胺，拟南芥中研究表明，SPDS 由两个基因编码：spd1和spd2。SPMS催化亚精胺与氨丙基结合生成精胺。而在茶树中未有SPDS和SPMS基因的报道。
本研究中通过RTPCR和RACE技术克隆茶树精胺合成酶基因CsSPMS的cDNA全长，并对其进行生物信息学分析和亚细胞定位，采用qRTPCR分析其在不同茶树品种、不同组织器官以及低温胁迫处理下的表达模式，探究多胺合成酶基因与茶树抗逆性的关系，为茶树抗逆基因工程提供候选基因资源和理论依据。
1. 材料与方法
1.1供试的材料
茶树（Camellia sinensis）材料‘迎霜’于2013年春季种植于人工气候箱。经4 ℃低温处理0、1、2、4、8、12和24 h分别取样后（设置对照22 ℃处理），立即在液氮中固定，并转移至–80 ℃保存备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α由大学茶学研究所实验室保存。rTaq酶、ExTaq酶、dNTPs、DNA Marker、T4 DNA连接酶、荧光定量染料SYBR GreenⅠ，购自TaKaRa公司。
1.2 保守片段的克隆
用RNA Total Kit（天根公司）提取茶树叶片总RNA。检测RNA质量、完整性后，用MMLV RTase cDNA Synthesis Kit（TaKaRa公司）将RNA反转录成cDNA。根据其他物种SPMS序列比对结果设计一对简并引物P01和P02（表1）。
以茶树叶片cDNA第一链为模板进行PCR扩增。PCR条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃延伸8 min。反应产物经琼脂糖凝胶电泳回收后连接pMD18T载体并转化至大肠杆菌菌株DH5α，PCR鉴定后提取质粒，由南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.3 RACE扩增基因全长
根据上述获得的片段序列设计5′、3′RACE引物，并结合通用引物分别扩增出该片段的5′端和3′端的序列，将序列拼接获得CsSPMS基因全长，以P06和P07为嵌套引物扩增该基因（表1）。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收后，连接pMD18T载体并转化至大肠杆菌菌株DH5α，PCR鉴定后提取质粒，由南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
表1 用于基因克隆与基因分析的引物序列
Table 1 Sequence of primers used in gene cloning and analysis
用途
Use
引物编号
Primer number
引物序列（5′–3′）
Primer sequence
简并引物Degenerate primer
P01
P02
TGGCCWGGAGARGCNCAYTC
ACCATCTTRTCWATYTCACA
接头引物Adaptor primer
P03
GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTT
5′特异扩增Special amplification of 5′ end
3′特异扩增Special amplification of 3′ end
P04
P05
TGGGCAGGACCAACAGG
CCTGGTGGTGTTCTTTGT
全长PCR Full length PCR
P06
P07
AGGGTTCTGTCCACTATGC
GGACGAAGAGCCTTTGCTACCG
亚细胞定位subcellular localization
P08
P09
AACAAGCTTATGGAGGACGGCGCAGGAAAA
CCCTCTAGATGAAACACAAATTTGTTGAGC
定量PCR Real time quantitative PCR
P10
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1.材料与方法4
1.1供试的茶树 5
1.2保守片段隆 5
1.3RACE扩增基因全长5
1.4序列分析5
1.5 SPMS蛋白的亚位6
1.6定量PCR分析 6
2. 结果与分析6
2.1茶树SPMS基因cDNA克隆 6
2.2茶树SPMS的氨基酸序列分析 7
2.3 CsSPMS编码蛋白的亚细胞定位7
2.4 CsSPMS在不同组织中的表达9
2.5 CsSPMS在低温胁迫下不同组织中的表达 9
3 讨论 10
致谢11
参考文献12
茶树精胺合成酶基因cDNA全长的克隆与表达分析
引言
引言
低温是限制农作物生长和地理分布的重要的非生物胁迫因子。如何提高茶树抗寒性，一直是茶叶生产与理论研究上迫切需要解决的问题。研究与了解茶树对低温的抗逆机制，有针对性地发掘相关抗性基因并加以利用，对茶树抗逆育种有非常重要的意义。
多胺可通过氨丙基转移酶参与植物多种生理代谢调节过程，尤其在提高植物抵抗逆境胁迫
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
中起到了重要作用。多胺作为一种与植物抗逆性有关的物质，能够缓解植物所受到的伤害。近年来的研究表明多胺作为抗性物质或信号传导物质参与小麦、拟南芥等抵御低温胁迫。研究发现，腐氨酸可以作为对番茄叶片冷胁迫的响应物质。同时，腐氨酸合酶缺失型拟南芥抗低温胁迫的能力明显下降。外源亚精胺和精胺可以提高冷胁迫香蕉叶中过氧化物酶的活性，提高香蕉的抗寒能力。亚精胺在抵御黄瓜低温胁迫中也起到了重要作用。
拟南芥和水稻中多胺生物合成路径已经基本探明有两条合成腐胺的途径，腐胺作为合成过程中最初的一种多胺在特定酶的作用下不断地添加氨丙基形成亚精胺和精胺，与此同时，甲硫氨酸脱去羧基也能形成亚精胺和精胺。从腐胺到精胺的生物合成，是经过两个合成酶—亚精胺合成酶和精胺合成酶的催化。SPDS催化腐胺生成亚精胺，拟南芥中研究表明，SPDS 由两个基因编码：spd1和spd2。SPMS催化亚精胺与氨丙基结合生成精胺。而在茶树中未有SPDS和SPMS基因的报道。
本研究中通过RTPCR和RACE技术克隆茶树精胺合成酶基因CsSPMS的cDNA全长，并对其进行生物信息学分析和亚细胞定位，采用qRTPCR分析其在不同茶树品种、不同组织器官以及低温胁迫处理下的表达模式，探究多胺合成酶基因与茶树抗逆性的关系，为茶树抗逆基因工程提供候选基因资源和理论依据。
1. 材料与方法
1.1供试的材料
茶树（Camellia sinensis）材料‘迎霜’于2013年春季种植于人工气候箱。经4 ℃低温处理0、1、2、4、8、12和24 h分别取样后（设置对照22 ℃处理），立即在液氮中固定，并转移至–80 ℃保存备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α由大学茶学研究所实验室保存。rTaq酶、ExTaq酶、dNTPs、DNA Marker、T4 DNA连接酶、荧光定量染料SYBR GreenⅠ，购自TaKaRa公司。
1.2 保守片段的克隆
用RNA Total Kit（天根公司）提取茶树叶片总RNA。检测RNA质量、完整性后，用MMLV RTase cDNA Synthesis Kit（TaKaRa公司）将RNA反转录成cDNA。根据其他物种SPMS序列比对结果设计一对简并引物P01和P02（表1）。
以茶树叶片cDNA第一链为模板进行PCR扩增。PCR条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃延伸8 min。反应产物经琼脂糖凝胶电泳回收后连接pMD18T载体并转化至大肠杆菌菌株DH5α，PCR鉴定后提取质粒，由南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.3 RACE扩增基因全长
根据上述获得的片段序列设计5′、3′RACE引物，并结合通用引物分别扩增出该片段的5′端和3′端的序列，将序列拼接获得CsSPMS基因全长，以P06和P07为嵌套引物扩增该基因（表1）。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收后，连接pMD18T载体并转化至大肠杆菌菌株DH5α，PCR鉴定后提取质粒，由南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
表1 用于基因克隆与基因分析的引物序列
Table 1 Sequence of primers used in gene cloning and analysis
用途
Use
引物编号
Primer number
引物序列（5′–3′）
Primer sequence
简并引物Degenerate primer
P01
P02
TGGCCWGGAGARGCNCAYTC
ACCATCTTRTCWATYTCACA
接头引物Adaptor primer
P03
GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTT
5′特异扩增Special amplification of 5′ end
3′特异扩增Special amplification of 3′ end
P04
P05
TGGGCAGGACCAACAGG
CCTGGTGGTGTTCTTTGT
全长PCR Full length PCR
P06
P07
AGGGTTCTGTCCACTATGC
GGACGAAGAGCCTTTGCTACCG
亚细胞定位subcellular localization
P08
P09
AACAAGCTTATGGAGGACGGCGCAGGAAAA
CCCTCTAGATGAAACACAAATTTGTTGAGC
定量PCR Real time quantitative PCR
P10
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