茶树γ谷氨酰转肽酶基因的克隆及其组织逆境表达差异的研究
本实验基“黄金芽”转录组数据，通过PCR方法从“黄金芽”中得到GGT1和GGT3基因，其中CsGGT1和CsGGT3基因分别含有1801和1861 bp的开放阅读框，编码599和619个氨基酸。从进化树、亲/疏水性、无序化特性、二级结构等方面进行预测与分析，结果表明大多数氨基酸属亲水性氨基酸，无序化特征比较明显，利用实时荧光定量 PCR 分析表明，在迎霜、安吉白茶、黄金芽 3 个茶树品种中 GGT1、GGT3 基因在茶树的不同组织表达存在明显差异，其中在3rd叶片中表达水平最高，而黄金芽在这三个品种中表达水平最高。GGT1和GGT3均受高温、低温诱导表达。其中GGT1在低温、高温均受抑制。GGT3在低温表达水平提高，在高温时受抑制。说明GGT基因在茶树温度胁迫中调控中存在作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言（或绪论）2
1 材料与方法2
1.1 植物实验材料 2
1.2总RNA提取 2
1.3总RNA的纯化及检测3
1.4cDNA合成3
1.5茶树CsGGT1和CsGGT3基因的克隆4
1.6pMD18T Vector连接4
1.7生物信息学分析6
2.实验结果6
2.1茶树CsGGT1与CsGGT3基因6 2.2 茶树CsGGT1和CsGGT3的进化分析9
2.3 茶树 CsGGT1和CsGGT3 转录因子推导氨基酸疏/亲水性和无序化分析9
2.4 茶树 CsGGT1和Cs转录因子的二级结构预测与分析9
2.5茶树 CsGGT1和CsGGT3基因的表达10
3.讨论15
致谢16
参考文献16
图1 不同物种GGT1和GGT3转录因子的系统进化树10
图2 茶树 CsGGT1和CsGGT3 氨基酸序列疏水、亲水性质分析12
图3 茶树 CsGGT1折叠状态的分析12
图 4 茶树CsGGT3折叠状态的分析13
图 5 CsGGT1 转录因子蛋白的二级结构 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
14
图 6 CsGGT3 转录因子蛋白的二级结构14
图 7 茶树中 CsGGT1和CsGGT3 基因在不同组织中的表达情况15
图 8 茶树中 CsGGT1和CsGGT3 基因在高低温处理下的表达情况15
茶树γ谷氨酰转肽酶基因的克隆及其组织逆境
表达差异的研究
引言
茶树(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze)，属于山茶科山茶属，是一种多年生常绿木本植物，也是全世界用于生产天然非酒精饮料的重要的叶用作物。L茶氨酸(LTheanine)是存在于茶叶内的一种主要氨基酸,为茶叶的主要呈味物质,广泛应用于医疗、保健、食品领域。近年来,不断有研究报道L茶氨酸具有降血压、抗肿瘤、神经保护等作用,其市场需求日益增长。现发现能催化茶氨酸生物合成的酶有：茶氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、γ谷氨酰甲胺合成酶、谷氨酰胺酶、γ谷氨酰转肽酶。[1]
γ谷氨酰转肽酶(γGlutamyltransferase ,GGT,EC:2.3.2.2)于1950年首次在绵羊肾中被发现，随后又在多种微生物和哺乳动物中被发现并被研究。[2]广泛存在于植物、动物以及微生物之中，其中对于微生物之中的GGT来源研究最为广泛，植物中如洋葱，萝卜。哺乳类如智人、小家鼠、绵羊。微生物如大肠杆菌，地衣芽孢杆菌等。
γ谷氨酰转肽酶(γGlutamyltransferase ,GGT,EC:2.3.2.2)可催化谷胱甘肽（Glutathione,GSH）,谷胱甘肽衍生物或其他含γ谷氨酰的化合物中的谷氨酰基团转移至其他氨基酸、二肽等受体形成新的谷氨酰衍生物。[3]其中以L谷氨酰胺（LGln）作为供体底物，乙胺为受体利用GGT可以转化为L茶氨酸。
目前国内外关于γ谷氨酰转肽酶研究主要应用于临床医学，人们常常通过血清学检测γ谷氨酰转肽酶特异性同工酶来鉴别诊断肝癌。在生物催化方面我国的研究尚处于起步阶段，而在日本医药、食品行业已有应用。[4]
其中合成L茶氨酸成为最近的热点，因为L茶氨酸在自然界中很少，但是其又具有很高的医用价值，所以利用γ谷氨酰转肽酶人工合成L茶氨酸具有重要意义。
γ谷氨酰转肽酶(γGlutamyltransferase ,GGT,EC:2.3.2.2)又称γ谷氨酰转移酶(GGT)，在生物体内广泛存在，是谷光甘肽（GSH）代谢的关键酶之一，并参与了氨基酸的跨膜转运，可特异性催化γ谷氨酰基的转移反应[5]。GGT具有转移或水解γ谷氨酰基的能力，在碱性条件下LGln的谷氨酰基转移到乙胺受体上，形成L茶氨酸[6]。所有GGT都由一条基因序列编码并转录成一条多肽链，并在自我催化作用下，分裂成大小两个亚基[7、8、9]。随着深入研究人们对γ谷氨酰转肽酶的催化功能和分子结构有了更多的了解，并发现其在临床上可作为肝胆疾病的生物标志，被广泛应用于肝病及其他脏器疾病的诊断和预后检测[1011]。在生物领域，利用细菌来源的GGT，可通过简单而廉价的供体和受体反应，合成不同的γ谷氨酰基化合物，其中研究最广发的是利用其合成L茶氨酸，此外，也可以用于合成一些新型的高附加值产品，如合成具广谱免疫调节作用的γGluTrp[12]。
茶树属于典型亚热带植物, 性喜暖湿气候, 不同的茶树品种抗寒性有所差异。‘安吉白茶’ (白叶茶)原产于浙江安吉, 是一种低温敏感型的茶树变异品种; ‘迎霜’春季发芽早, 秋冬季休眠迟, 霜降季节茶芽仍能抽发, 具有较强的抗低温能力; ‘黄金芽’一年三季均可采制，而且即使在夏秋季节品质也不逊于其他春茶，可作为高档珍奇茶品来开发。基于本课题组茶树‘黄金芽’的转录组数据, 利用RTPCR方法从茶树中分离同属于GGT转录因子的CsGGT1和CsGGT3基因, 并对其进行了较为详尽的分析, 包括序列比对、进化树、理化性质、亲/疏水性、无序化特性、二级和三级结构等。为了进一步分析不同茶树中上述基因温度响应的差异,选取上述3个抗寒性不同的茶树材料‘迎霜’、‘安吉白茶’、‘黄金芽’, 利用荧光定量PCR对CsGGT1和CsGGT3基因在高温和低温胁迫下的表达情况进行了分析, 以期为深入了解茶树温度胁迫响应机制提供借鉴。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言（或绪论）2
1 材料与方法2
1.1 植物实验材料 2
1.2总RNA提取 2
1.3总RNA的纯化及检测3
1.4cDNA合成3
1.5茶树CsGGT1和CsGGT3基因的克隆4
1.6pMD18T Vector连接4
1.7生物信息学分析6
2.实验结果6
2.1茶树CsGGT1与CsGGT3基因6 2.2 茶树CsGGT1和CsGGT3的进化分析9
2.3 茶树 CsGGT1和CsGGT3 转录因子推导氨基酸疏/亲水性和无序化分析9
2.4 茶树 CsGGT1和Cs转录因子的二级结构预测与分析9
2.5茶树 CsGGT1和CsGGT3基因的表达10
3.讨论15
致谢16
参考文献16
图1 不同物种GGT1和GGT3转录因子的系统进化树10
图2 茶树 CsGGT1和CsGGT3 氨基酸序列疏水、亲水性质分析12
图3 茶树 CsGGT1折叠状态的分析12
图 4 茶树CsGGT3折叠状态的分析13
图 5 CsGGT1 转录因子蛋白的二级结构 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
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图 6 CsGGT3 转录因子蛋白的二级结构14
图 7 茶树中 CsGGT1和CsGGT3 基因在不同组织中的表达情况15
图 8 茶树中 CsGGT1和CsGGT3 基因在高低温处理下的表达情况15
茶树γ谷氨酰转肽酶基因的克隆及其组织逆境
表达差异的研究
引言
茶树(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze)，属于山茶科山茶属，是一种多年生常绿木本植物，也是全世界用于生产天然非酒精饮料的重要的叶用作物。L茶氨酸(LTheanine)是存在于茶叶内的一种主要氨基酸,为茶叶的主要呈味物质,广泛应用于医疗、保健、食品领域。近年来,不断有研究报道L茶氨酸具有降血压、抗肿瘤、神经保护等作用,其市场需求日益增长。现发现能催化茶氨酸生物合成的酶有：茶氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、γ谷氨酰甲胺合成酶、谷氨酰胺酶、γ谷氨酰转肽酶。[1]
γ谷氨酰转肽酶(γGlutamyltransferase ,GGT,EC:2.3.2.2)于1950年首次在绵羊肾中被发现，随后又在多种微生物和哺乳动物中被发现并被研究。[2]广泛存在于植物、动物以及微生物之中，其中对于微生物之中的GGT来源研究最为广泛，植物中如洋葱，萝卜。哺乳类如智人、小家鼠、绵羊。微生物如大肠杆菌，地衣芽孢杆菌等。
γ谷氨酰转肽酶(γGlutamyltransferase ,GGT,EC:2.3.2.2)可催化谷胱甘肽（Glutathione,GSH）,谷胱甘肽衍生物或其他含γ谷氨酰的化合物中的谷氨酰基团转移至其他氨基酸、二肽等受体形成新的谷氨酰衍生物。[3]其中以L谷氨酰胺（LGln）作为供体底物，乙胺为受体利用GGT可以转化为L茶氨酸。
目前国内外关于γ谷氨酰转肽酶研究主要应用于临床医学，人们常常通过血清学检测γ谷氨酰转肽酶特异性同工酶来鉴别诊断肝癌。在生物催化方面我国的研究尚处于起步阶段，而在日本医药、食品行业已有应用。[4]
其中合成L茶氨酸成为最近的热点，因为L茶氨酸在自然界中很少，但是其又具有很高的医用价值，所以利用γ谷氨酰转肽酶人工合成L茶氨酸具有重要意义。
γ谷氨酰转肽酶(γGlutamyltransferase ,GGT,EC:2.3.2.2)又称γ谷氨酰转移酶(GGT)，在生物体内广泛存在，是谷光甘肽（GSH）代谢的关键酶之一，并参与了氨基酸的跨膜转运，可特异性催化γ谷氨酰基的转移反应[5]。GGT具有转移或水解γ谷氨酰基的能力，在碱性条件下LGln的谷氨酰基转移到乙胺受体上，形成L茶氨酸[6]。所有GGT都由一条基因序列编码并转录成一条多肽链，并在自我催化作用下，分裂成大小两个亚基[7、8、9]。随着深入研究人们对γ谷氨酰转肽酶的催化功能和分子结构有了更多的了解，并发现其在临床上可作为肝胆疾病的生物标志，被广泛应用于肝病及其他脏器疾病的诊断和预后检测[1011]。在生物领域，利用细菌来源的GGT，可通过简单而廉价的供体和受体反应，合成不同的γ谷氨酰基化合物，其中研究最广发的是利用其合成L茶氨酸，此外，也可以用于合成一些新型的高附加值产品，如合成具广谱免疫调节作用的γGluTrp[12]。
茶树属于典型亚热带植物, 性喜暖湿气候, 不同的茶树品种抗寒性有所差异。‘安吉白茶’ (白叶茶)原产于浙江安吉, 是一种低温敏感型的茶树变异品种; ‘迎霜’春季发芽早, 秋冬季休眠迟, 霜降季节茶芽仍能抽发, 具有较强的抗低温能力; ‘黄金芽’一年三季均可采制，而且即使在夏秋季节品质也不逊于其他春茶，可作为高档珍奇茶品来开发。基于本课题组茶树‘黄金芽’的转录组数据, 利用RTPCR方法从茶树中分离同属于GGT转录因子的CsGGT1和CsGGT3基因, 并对其进行了较为详尽的分析, 包括序列比对、进化树、理化性质、亲/疏水性、无序化特性、二级和三级结构等。为了进一步分析不同茶树中上述基因温度响应的差异,选取上述3个抗寒性不同的茶树材料‘迎霜’、‘安吉白茶’、‘黄金芽’, 利用荧光定量PCR对CsGGT1和CsGGT3基因在高温和低温胁迫下的表达情况进行了分析, 以期为深入了解茶树温度胁迫响应机制提供借鉴。
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