安吉白茶莽草酸脱氢酶基因克隆及序列分析
目录
摘要 1
关键字 1
引言 1
1材料与方法 1
1.1材料 1
1.1.1 实验材料 1
1.1.2实验试剂 1
1.2 方法 2
1.2.1 茶树总RNA提取及纯化(华越洋试剂盒) 2
1.2.2 总RNA反转录反应 2
1.2.3 中间片段引物的设计 2
1.2.4 茶SDH基因的中间片段的合成 2
1.2.5 胶回收 3
1.2.6 构建重组质粒 3
1.2.7 重组质粒的鉴定与测序 3
1.2.8 3’RACE与5’RACE引物设计 3
1.2.9 3’RACE 3
1.2.10 5’RACE 4
1.2.11 全长基因引物设计 4
1.2.12 全长基因克隆 4
2结果与分析 5
2.1安吉白茶总RNA质量分析 5
2.2 安吉白茶SDH中间片段、5’RACE 和3’RACE 扩增产物的电泳检测 5
2.3 安吉白茶SDH基因全长扩增产物的电泳检测 6
2.4 安吉白茶SDH基因序列测序及NCBI验证 6
2.5 SDH蛋白质的特征分析 6
2.5.1 SDH氨基酸组成及理化性质分析 6
2.5.2 SDH蛋白亲水/疏水性分析 7
2.5.3 SDH蛋白信号肽预测 7
2.5.4 SDH蛋白磷酸化位点预测与分析 8
3 讨论 8
致谢 8
参考文献： 9
Abstract 10
key words 10
附录1：Camellia sinensis shikimate dehydrogenase mRNA, complete cds 11
附录2：Camellia sinensis shikimate dehydrogenase 氨基酸序列 11
安吉白茶莽草酸脱氢酶基因克隆及序列分析
【摘要 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
】目的：克隆安吉白茶莽草酸脱氢酶基因（SDH）以获得全长cDNA序列并进行序列分析。方法：通过比对物种SDH基因序列设计中间片段引物，并用RTPCR技术获得基因片段，以此序列设计3’RACE、5’RACE引物，获得3’RACE、5’RACE序列，再设计出全长基因引物，最终通过高保真PCR合成SDH基因，结合生物信息学方法对所获的序列进行开放阅读框、序列同源性分析，并预测了蛋白质的理化性质、亲水性/疏水性、信号肽、磷酸化位点。 结果：成功克隆了安吉白茶SDH基因的全长cDNA 序列，并通过NBCI等分析其序列。 结论：经上述方法克隆出的基因为安吉白茶SDH基因的全长cDNA， cDNA 全长为1985 bp，开放阅读框（ORF）长度为1566 bp，编码522个氨基酸。经生物信息学分析，SDH蛋白的氨基酸残基数为522，分子量为56701.5 Da，理论等电点（PI）为6.51。SDH蛋白不存在信号肽序列，属于亲水性的非分泌蛋白，其磷酸化位点有26个。
【关键字】：安吉白茶；莽草酸脱氢酶；全长cDNA 克隆；序列分析
茶叶儿茶素、咖啡碱、茶氨酸等茶树次生代谢产物是与人体健康密切相关的物质，具有广阔的应用前景，如茶多酚具有抗氧化、清除自由基、抗肿瘤、抗菌[1~5]等多种生物学活性。莽草酸是合成许多生物碱、芳香氨基酸、吲哚衍生物与手性药物（如抗病毒药）的前体，莽草酸途径是芳香族氨基酸合成过程中的一段共同代谢途径，肩负着连接糖代谢和次生代谢的重任。莽草酸脱氢酶作为莽草酸途径的关键酶之一，克隆莽草酸脱氢酶基因的全长 cDNA，为测定其基因序列及利用基因工程有效控制莽草酸途径中的关键酶活性，改变次生代谢流向，提高此生代谢产物含量提供便利。
茶树中对莽草酸脱氢酶基因的研究较少，主要集中在对酶特性的研究[6]，未见对于该基因克隆方面的研究。而国内对于大肠杆菌内的莽草酸途径研究较为详尽，包括莽草酸脱氢酶基因的克隆和表达[7]、合成途径的调控[810]。结核分支杆菌也有见相关莽草酸脱氢酶的克隆[11]。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1 实验材料
供试材料为安吉白茶春天第一次的芽头，锡纸包裹后迅速保存于液氮中。
1.1.2实验试剂
反转录试剂盒(TatKaRa)； PrimeSTAR(TaKaRa)；pMD19T vector(TaKaRa) ；大肠杆菌DH5α(TaKaRa)；抗生素；dNTP；无水乙醇；次氯酸钠等。
1.1.3 实验器材
离心机（Eppendorf Centrifuge 5810R）；单人单面净化工作台（苏州净化，SWCJIFD型）； PCR机(TaKaRa)；恒温水槽(HS800D)； pH计（雷磁，PHS3C）；凝胶成像分析系统（培清科技）；Spectrophotometer（UV5200）；移液枪(Eppendorf系列)；分子杂交炉(LF1)； SHAKER INCUBATOR(TS200B)；摇床(天呈)；立式压力蒸汽灭菌器(LDZX30KBS)；电泳仪电源(DYY6C)；数显恒温水浴锅（HHS4）。
1.2 方法
1.2.1 茶树总RNA提取及纯化(华越洋试剂盒)
1.2.1.1 茶树总RNA的提取
将组织在液氮中磨碎后，每50~100mg组织加1ml裂解液RZ研磨至水状，转移1ml液体至干净的1.5ml离心管中，向离心管中加入300μL的去蛋白液（取下层）和200μL自备氯仿，振荡30s，使溶液呈乳状。室温，12000g，离心510min，取上清液至新的1.5ml离心管，加入等体积漂洗液，充分颠倒混匀。将混合物分次加入柱子中，每次少于700μL。室温，12000g，离心1min，弃滤液。向柱子中加入500μL洗柱液，室温，12000g，1min，弃滤液，重复一次。
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