转ospt2基因菜用大豆耐低磷鉴定
摘 要土壤低磷限制着菜用大豆的生产。植物磷转运蛋白基因在磷的吸收及转运过程中起着关键作用。本试验采用改良的Hoagland营养液栽培方法，对转OsPT2基因菜用大豆的T2代株系进行耐低磷试验，结果显示在低磷及正常磷条件下，转基因植株的有效磷及总磷含量均显著高于非转基因（NT）植株。在低磷胁迫下，转基因植株未出现缺磷症状，且生长状态显著优于NT植株。试验表明，转基因菜用大豆过表达OsPT2基因可提高植株磷的积累，在低磷条件下，改善植株生长状态。
目录
摘要1
关键词1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料 2
1.1.1 试验材料 2
1.1.2 试剂2
1.2 试验方法2
1.2.1 半定量RTPCR检测OsPT2基因表达情况2
1.2.2 低磷试验3
1.2.3 生理生化指标测定3
1.2.4 数据分析3
2 结果分析 3
2.1转基因植株分子检测3
2.2 低磷胁迫对T2代转基因植株磷含量的影响 4
2.3 低磷胁迫对T2代转基因植株生长的影响5
3讨论7
致谢8
参考文献9
转OsPT2基因菜用大豆耐低磷鉴定
引言
我国南方地区是菜用大豆主要生产地，但其酸性红壤中有效磷含量非常低，且土壤中磷扩散速率远低于植物根部吸收磷的速率(Vance et al.,2003)，菜用大豆的生产逐渐受到限制。作为植物代谢的关键元素及细胞重要组成成分(Rouached et al.,2010)，磷被认为是对大豆最为重要的元素，主要原因是根瘤菌固氮作用及种子含有大量的蛋白质及植物油(Qin et al.,2012)。大豆缺磷能够导致多种严重的影响，其中之一便是限制其他元素的吸收(Win et al.,2010)，从而影响产量及品质。因此，提高菜用大豆磷吸收及利用效率是增加产量及提高营养品质的最有效的方法(Shah et al.,2001)。
最近几年，研究人员逐渐关注提高磷吸收的机制及植物的磷代谢途径(Guo et al.,2013)。磷转 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
运系统是植物磷吸收及体内再分配最重要的系统(Smith et al.,2003)。水稻磷转运蛋白基因OsPT2主要起到磷转运作用。敲除OsPT2 基因可同时降低磷的吸收和从根到地上部的长距离运输；超表达OsPT2基因能够引起磷在转基因水稻地上部过度积累而导致植株磷中毒(Liu et al.,2010b)。这些研究表明，OsPT2可通过基因工程用于作物的耐低磷改良。
到目前为止，已有多种作物通过导入磷转运蛋白基因提高磷的利用效率，如水稻、小麦及烟草等(Guo et al.,2013)。然而，提高菜用大豆磷吸收的工作少有报道。本试验将超表达的转基因菜用大豆T2代植株进行耐低磷性试验，旨在获得磷高效利用的转基因菜用大豆新种质。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1试验材料
转OsPT2菜用大豆T2代植株。
1.1.2 试剂
所用试剂均为国产分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1半定量RTPCR检测OsPT2基因表达情况
提取叶片与根的总RNA，反转录后用于半定量RTPCR检测。以大豆TefS1基因（编码伸长因子EF1a: X56856）为看家基因（表1）。使用集成凝胶显像系统（GenoSens 1880,上海勤翔科技有限公司，中国）进行溴化乙锭染色后的凝胶图像获取及分析。设定看家基因TefS1基因的光密度为1，OsPT2基因的光密度与其比值为OsPT2基因的相对表达量。
表1 半定量RTPCR检测OsPT2表达的引物序列
Table 1 Sequence of primers used in the semi quantitative PCR
引物
Primers name
核酸序列
Nucleotide sequence (5’→3’)
退火温度
Annealling temperature (℃)
产物长度
Product size (bp)
OsPT2
FP
AGGCACTCATCGCACTCT
55
444
RP
GCATACCGAGGAAGTTTGT
TefS1
FT
TGCAAAGGAGGCTGCTAACT
55
200
RT
CAGCATCACCGTTCTTCAAA
1.2.2 低磷试验
三个超表达OsPT2转基因T2代株系（12PT21，12PT22及12PT24）10天苗岭的植株与对照（WT）10天苗岭的植株定植于含有改良的Hoagland营养液（用NH4Cl代替部分NH4H2PO4，磷最终浓度为20 μM；其他离子浓度不变；EC = 2.61 dSm1）中。对营养液进行连续通氧，并每三天更换一次（用HCl或NaOH调节pH值至6.5）。每个T2代株系10棵植株用于重复试验。以标准Hoagland营养液为对照。温室环境采用人工控制，昼夜温度：28°C/20°C, 光周期：12 h/12 h（HPS灯，PPFD：600 μmol.m2.s1），相对湿度：70–80%，CO2浓度：400 μM。
1.2.3 生理生化指标测定
低磷处理期间观察各植株症状。低磷处理30天后测量植株的株高、根长、最大叶面积等形态学指标。有效磷及全磷含量的测定参照Zhou等(2008)的方法。生殖生长期测定花数、荚数等；种子收获后测定单株种子数及种子重量。
1.2.4 数据分析
数据采用SAS软件（SAS Institute, Cary, NC, USA）进行相关差异显著性分析，多组数据用LSD法进行分析（P < 0.05）。直方图用Origin 8.5 软件（Microcal, USA）绘制。
2 结果与分析
2.1 转基因植株分子检测
提T2代植株取叶片和根的总RNA，反转录成cDNA 后进行半定量RTPCR，以TefS1为看家基因，检测OsPT2基因的表达，结果显示OsPT2基因均在3个株系中超表达（图1C）。光密度分析OsPT2基因相对表达量，结果显示OsPT2基因相对看家基因的表达水平为1.21.4倍（图1B）。
图1 半定量RTPCT检测OsPT2基因表达
目录
摘要1
关键词1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料 2
1.1.1 试验材料 2
1.1.2 试剂2
1.2 试验方法2
1.2.1 半定量RTPCR检测OsPT2基因表达情况2
1.2.2 低磷试验3
1.2.3 生理生化指标测定3
1.2.4 数据分析3
2 结果分析 3
2.1转基因植株分子检测3
2.2 低磷胁迫对T2代转基因植株磷含量的影响 4
2.3 低磷胁迫对T2代转基因植株生长的影响5
3讨论7
致谢8
参考文献9
转OsPT2基因菜用大豆耐低磷鉴定
引言
我国南方地区是菜用大豆主要生产地，但其酸性红壤中有效磷含量非常低，且土壤中磷扩散速率远低于植物根部吸收磷的速率(Vance et al.,2003)，菜用大豆的生产逐渐受到限制。作为植物代谢的关键元素及细胞重要组成成分(Rouached et al.,2010)，磷被认为是对大豆最为重要的元素，主要原因是根瘤菌固氮作用及种子含有大量的蛋白质及植物油(Qin et al.,2012)。大豆缺磷能够导致多种严重的影响，其中之一便是限制其他元素的吸收(Win et al.,2010)，从而影响产量及品质。因此，提高菜用大豆磷吸收及利用效率是增加产量及提高营养品质的最有效的方法(Shah et al.,2001)。
最近几年，研究人员逐渐关注提高磷吸收的机制及植物的磷代谢途径(Guo et al.,2013)。磷转 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
运系统是植物磷吸收及体内再分配最重要的系统(Smith et al.,2003)。水稻磷转运蛋白基因OsPT2主要起到磷转运作用。敲除OsPT2 基因可同时降低磷的吸收和从根到地上部的长距离运输；超表达OsPT2基因能够引起磷在转基因水稻地上部过度积累而导致植株磷中毒(Liu et al.,2010b)。这些研究表明，OsPT2可通过基因工程用于作物的耐低磷改良。
到目前为止，已有多种作物通过导入磷转运蛋白基因提高磷的利用效率，如水稻、小麦及烟草等(Guo et al.,2013)。然而，提高菜用大豆磷吸收的工作少有报道。本试验将超表达的转基因菜用大豆T2代植株进行耐低磷性试验，旨在获得磷高效利用的转基因菜用大豆新种质。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1试验材料
转OsPT2菜用大豆T2代植株。
1.1.2 试剂
所用试剂均为国产分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1半定量RTPCR检测OsPT2基因表达情况
提取叶片与根的总RNA，反转录后用于半定量RTPCR检测。以大豆TefS1基因（编码伸长因子EF1a: X56856）为看家基因（表1）。使用集成凝胶显像系统（GenoSens 1880,上海勤翔科技有限公司，中国）进行溴化乙锭染色后的凝胶图像获取及分析。设定看家基因TefS1基因的光密度为1，OsPT2基因的光密度与其比值为OsPT2基因的相对表达量。
表1 半定量RTPCR检测OsPT2表达的引物序列
Table 1 Sequence of primers used in the semi quantitative PCR
引物
Primers name
核酸序列
Nucleotide sequence (5’→3’)
退火温度
Annealling temperature (℃)
产物长度
Product size (bp)
OsPT2
FP
AGGCACTCATCGCACTCT
55
444
RP
GCATACCGAGGAAGTTTGT
TefS1
FT
TGCAAAGGAGGCTGCTAACT
55
200
RT
CAGCATCACCGTTCTTCAAA
1.2.2 低磷试验
三个超表达OsPT2转基因T2代株系（12PT21，12PT22及12PT24）10天苗岭的植株与对照（WT）10天苗岭的植株定植于含有改良的Hoagland营养液（用NH4Cl代替部分NH4H2PO4，磷最终浓度为20 μM；其他离子浓度不变；EC = 2.61 dSm1）中。对营养液进行连续通氧，并每三天更换一次（用HCl或NaOH调节pH值至6.5）。每个T2代株系10棵植株用于重复试验。以标准Hoagland营养液为对照。温室环境采用人工控制，昼夜温度：28°C/20°C, 光周期：12 h/12 h（HPS灯，PPFD：600 μmol.m2.s1），相对湿度：70–80%，CO2浓度：400 μM。
1.2.3 生理生化指标测定
低磷处理期间观察各植株症状。低磷处理30天后测量植株的株高、根长、最大叶面积等形态学指标。有效磷及全磷含量的测定参照Zhou等(2008)的方法。生殖生长期测定花数、荚数等；种子收获后测定单株种子数及种子重量。
1.2.4 数据分析
数据采用SAS软件（SAS Institute, Cary, NC, USA）进行相关差异显著性分析，多组数据用LSD法进行分析（P < 0.05）。直方图用Origin 8.5 软件（Microcal, USA）绘制。
2 结果与分析
2.1 转基因植株分子检测
提T2代植株取叶片和根的总RNA，反转录成cDNA 后进行半定量RTPCR，以TefS1为看家基因，检测OsPT2基因的表达，结果显示OsPT2基因均在3个株系中超表达（图1C）。光密度分析OsPT2基因相对表达量，结果显示OsPT2基因相对看家基因的表达水平为1.21.4倍（图1B）。
图1 半定量RTPCT检测OsPT2基因表达
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