葡萄叶片中自噬相关基因的克隆及表达分析
摘要：本实验以‘魏可’葡萄为试材，通过对葡萄叶片老化过程中叶绿素含量变化以及8个ATG基因的表达分析，研究了葡萄叶片老化、叶绿素的分解和细胞自噬的关系。葡萄的抗逆研究，主要包括抗病虫害、抗盐、抗旱等一直是国内外葡萄研究的重要课题。本实验通过对葡萄实施各种胁迫处理（病虫害，盐，干旱，水，黑暗），并对8个ATG基因在叶片中的表达进行分析，研究了细胞自噬在葡萄适应或抵抗环境胁迫中的作用。
目录
引言 1
1 试验材料 2
1.1 材料及其处理 2
2 方法 2
2.1 实验方案 2
2.2 激光共聚焦显微镜观察自噬小体 2
2.3 果实生长及成熟过程中相关基因表达分析 2
2.3.1 葡萄叶片总RNA的提取 2
2.3.2 总RNA中的DNA消化 3
2.3.3 CDNA第一链的合成与质量检测 3
2.3.4 荧光定量PCR 4
3 结果与分析 4
3.1 不同胁迫条件下葡萄叶片自噬情况观察 4
3.2 不同胁迫条件下葡萄叶片自噬相关基因的表达情况 5
3.2.1 盐胁迫下自噬相关基因的表达情况 5
3.2.2 涝害胁迫下自噬相关基因的表达情况 5
3.2.3 高温胁迫下自噬相关基因的表达情况 6
3.2.4 黑暗胁迫下自噬相关基因的表达情况 6
3.2.5 干旱胁迫下自噬相关基因的表达情况 7
3.2.6 灰霉病感染下自噬相关基因的表达情况 7
4 讨论 8
致谢 8
参考文献 9
葡萄叶片中自噬相关基因的克隆及表达分析
引言
引言
葡萄营养价值高，素有“水果皇后”之称[1]，一直以来很受消费者青睐。近年来，随着人们生活水平的提高，人们对水果的要求也不断提高，现今水果市场的竞争也越来越激烈，于是果实品质的提高及果实的周年供应是迫切需要解决的问题，这对果实的商品价值及满足市场多元化的需求具有重要意义。植物生存过程中会不断地遭遇各种环境因素的改变，这些
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外界因环境的改变破坏了植物细胞内PH、渗透压、活性氧代谢平衡等，使细胞器和胞内蛋白等物质遭受破坏，这些受损细胞器和蛋白的快速降解对于维持细胞稳态和植物生存具有至关重要的作用。植物经过长期的进化，发展出了完善的蛋白降解途径，细胞自噬途径是植物最重要的蛋白降解途径之一[2]，它能够对细胞内长寿命的蛋白或者功能异常的细胞器如功能受损的线粒体、过氧化物酶体等进行大批量的降解。因此在植物响应外界胁迫过程中起重要作用。除此之外，细胞自噬还参与到开花[3]，果实成熟，叶片衰老，根的伸长和根毛发育等植物的生长发育过程中，细胞自噬通过降解种子或者花芽等组织中储存的蛋白等营养物质，参与到种子萌发和花的发育中，还可以通过降解组织衰老过程中产生的破损或者长寿命蛋白进而参与组织衰老过程的调控[12]。作为真核生物界保守的蛋白降解机制，细胞自噬在植物中的研究逐渐深入。葡萄(Vitis vinifera L.)是世界上栽培面积最广的果树树种之一，葡萄细胞自噬相关基因功能的研究对于认识葡萄细胞自噬作用机理，研究逆境胁迫下葡萄生长发育机理以及胁迫响应机制都具有重要的意义，对细胞自噬理论在其他果树树种中的研究也提供重要的理论基础。
植物细胞自噬作为植物生命过程中不可或缺的蛋白降解途径，具有多种生理功能[4]。在植物衰老过程中，细胞自噬通过促进营养物质循环利用进而调节组织衰老进程[10]；在植物遭受逆境胁迫时，又可通过降低活性氧的积累进而参与到植物胁迫反应中，同时还可通过降解淀粉和蛋白等储存营养物质参与到种子萌发和开花等生理过程[11]。另一方面在植物遭受病原菌感染时，细胞自噬又可通过控制细胞程序性死亡（PCD），进而控制病原菌的感染[5]。
1 试验材料
1.1 材料及其处理
以种植于江苏省农博园3年生适应性强、果粒大小均匀、糖分含量高的葡萄品种‘魏可’作为实验试材，于2015年5月初10月分阶段采集叶片。2015年11月2016年2月在采集叶片之后对叶片进行叶绿素含量测定，RNA提取，引物设计等操作，2016年3月4月提取的RNA反转录，进行实时荧光定量PCR分析，基因克隆。取样时用干净纸巾拭去葡萄叶片表面尘土后立即放入冰盒，带回实验室，液氮速冻，贮于40℃冰箱备用。用于分析叶片叶绿素含量以及RNA的提取。
2 方法
2.1 实验方案
本实验所用材料皆采自江苏省农博园3年生‘魏可’（‘wink’）葡萄。
叶片衰老过程：分别于新叶展开后10、30、50、70、90、110采样，清洗干净，迅速用液氮处理，保存于40℃备用。
病虫害：采摘感染葡萄霜霉病的病叶数片，清洗干净，迅速用液氮处理，于40℃长期保存备用。
盐处理：对葡萄根系土壤分别施0.6%，0.8%，1.2%的Nacl和0.04%，0.06%，0.10%的CuSO4，于0h，24h，48h，72h后采相同节位的叶片，清洗干净，迅速用液氮处理，保存于40℃备用。
灌水处理：保持葡萄栽培盆中始终处于满水状态，于0h,24h,48h,72h,96h,120h后采同节位叶片，清洗干净，迅速用液氮处理，保存于40℃备用。
黑暗处理：选取发育时期相同的叶片，用锡箔纸包裹，不透光。分别于2天，4天，6天，8天，10天后采摘，清洗干净，迅速用液氮处理，保存于40℃备用。
2.2 激光共聚焦显微镜观察自噬小体
LysoTracker green DND26染色及观察方法参考[6]，在此基础上，略有改进。取各处理叶片，用镊子撕掉下表皮，切成1cm长宽大小，放入1uM LysoTracker green DND26溶液中[16]，真空抽滤15分钟，期间应尽量避光。再在室温条件下放置30分钟，用PBS缓冲液冲洗3次，制片并通过激光共聚焦显微镜观察。采用激光共聚焦荧光显微镜(CLSM ,BioRad MR/A2 confocal laser scanning microscope)观察[7]，激发光波长为488 nm[15]。分别观察CK和盐胁迫，黑暗胁迫，干旱胁迫2天下的葡萄叶片自噬情况。
2.3 果实生长及成熟过程中相关基因表达分析
2.3.1 葡萄叶片总RNA的提取
目录
引言 1
1 试验材料 2
1.1 材料及其处理 2
2 方法 2
2.1 实验方案 2
2.2 激光共聚焦显微镜观察自噬小体 2
2.3 果实生长及成熟过程中相关基因表达分析 2
2.3.1 葡萄叶片总RNA的提取 2
2.3.2 总RNA中的DNA消化 3
2.3.3 CDNA第一链的合成与质量检测 3
2.3.4 荧光定量PCR 4
3 结果与分析 4
3.1 不同胁迫条件下葡萄叶片自噬情况观察 4
3.2 不同胁迫条件下葡萄叶片自噬相关基因的表达情况 5
3.2.1 盐胁迫下自噬相关基因的表达情况 5
3.2.2 涝害胁迫下自噬相关基因的表达情况 5
3.2.3 高温胁迫下自噬相关基因的表达情况 6
3.2.4 黑暗胁迫下自噬相关基因的表达情况 6
3.2.5 干旱胁迫下自噬相关基因的表达情况 7
3.2.6 灰霉病感染下自噬相关基因的表达情况 7
4 讨论 8
致谢 8
参考文献 9
葡萄叶片中自噬相关基因的克隆及表达分析
引言
引言
葡萄营养价值高，素有“水果皇后”之称[1]，一直以来很受消费者青睐。近年来，随着人们生活水平的提高，人们对水果的要求也不断提高，现今水果市场的竞争也越来越激烈，于是果实品质的提高及果实的周年供应是迫切需要解决的问题，这对果实的商品价值及满足市场多元化的需求具有重要意义。植物生存过程中会不断地遭遇各种环境因素的改变，这些
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外界因环境的改变破坏了植物细胞内PH、渗透压、活性氧代谢平衡等，使细胞器和胞内蛋白等物质遭受破坏，这些受损细胞器和蛋白的快速降解对于维持细胞稳态和植物生存具有至关重要的作用。植物经过长期的进化，发展出了完善的蛋白降解途径，细胞自噬途径是植物最重要的蛋白降解途径之一[2]，它能够对细胞内长寿命的蛋白或者功能异常的细胞器如功能受损的线粒体、过氧化物酶体等进行大批量的降解。因此在植物响应外界胁迫过程中起重要作用。除此之外，细胞自噬还参与到开花[3]，果实成熟，叶片衰老，根的伸长和根毛发育等植物的生长发育过程中，细胞自噬通过降解种子或者花芽等组织中储存的蛋白等营养物质，参与到种子萌发和花的发育中，还可以通过降解组织衰老过程中产生的破损或者长寿命蛋白进而参与组织衰老过程的调控[12]。作为真核生物界保守的蛋白降解机制，细胞自噬在植物中的研究逐渐深入。葡萄(Vitis vinifera L.)是世界上栽培面积最广的果树树种之一，葡萄细胞自噬相关基因功能的研究对于认识葡萄细胞自噬作用机理，研究逆境胁迫下葡萄生长发育机理以及胁迫响应机制都具有重要的意义，对细胞自噬理论在其他果树树种中的研究也提供重要的理论基础。
植物细胞自噬作为植物生命过程中不可或缺的蛋白降解途径，具有多种生理功能[4]。在植物衰老过程中，细胞自噬通过促进营养物质循环利用进而调节组织衰老进程[10]；在植物遭受逆境胁迫时，又可通过降低活性氧的积累进而参与到植物胁迫反应中，同时还可通过降解淀粉和蛋白等储存营养物质参与到种子萌发和开花等生理过程[11]。另一方面在植物遭受病原菌感染时，细胞自噬又可通过控制细胞程序性死亡（PCD），进而控制病原菌的感染[5]。
1 试验材料
1.1 材料及其处理
以种植于江苏省农博园3年生适应性强、果粒大小均匀、糖分含量高的葡萄品种‘魏可’作为实验试材，于2015年5月初10月分阶段采集叶片。2015年11月2016年2月在采集叶片之后对叶片进行叶绿素含量测定，RNA提取，引物设计等操作，2016年3月4月提取的RNA反转录，进行实时荧光定量PCR分析，基因克隆。取样时用干净纸巾拭去葡萄叶片表面尘土后立即放入冰盒，带回实验室，液氮速冻，贮于40℃冰箱备用。用于分析叶片叶绿素含量以及RNA的提取。
2 方法
2.1 实验方案
本实验所用材料皆采自江苏省农博园3年生‘魏可’（‘wink’）葡萄。
叶片衰老过程：分别于新叶展开后10、30、50、70、90、110采样，清洗干净，迅速用液氮处理，保存于40℃备用。
病虫害：采摘感染葡萄霜霉病的病叶数片，清洗干净，迅速用液氮处理，于40℃长期保存备用。
盐处理：对葡萄根系土壤分别施0.6%，0.8%，1.2%的Nacl和0.04%，0.06%，0.10%的CuSO4，于0h，24h，48h，72h后采相同节位的叶片，清洗干净，迅速用液氮处理，保存于40℃备用。
灌水处理：保持葡萄栽培盆中始终处于满水状态，于0h,24h,48h,72h,96h,120h后采同节位叶片，清洗干净，迅速用液氮处理，保存于40℃备用。
黑暗处理：选取发育时期相同的叶片，用锡箔纸包裹，不透光。分别于2天，4天，6天，8天，10天后采摘，清洗干净，迅速用液氮处理，保存于40℃备用。
2.2 激光共聚焦显微镜观察自噬小体
LysoTracker green DND26染色及观察方法参考[6]，在此基础上，略有改进。取各处理叶片，用镊子撕掉下表皮，切成1cm长宽大小，放入1uM LysoTracker green DND26溶液中[16]，真空抽滤15分钟，期间应尽量避光。再在室温条件下放置30分钟，用PBS缓冲液冲洗3次，制片并通过激光共聚焦显微镜观察。采用激光共聚焦荧光显微镜(CLSM ,BioRad MR/A2 confocal laser scanning microscope)观察[7]，激发光波长为488 nm[15]。分别观察CK和盐胁迫，黑暗胁迫，干旱胁迫2天下的葡萄叶片自噬情况。
2.3 果实生长及成熟过程中相关基因表达分析
2.3.1 葡萄叶片总RNA的提取
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