葡萄asr基因功能的研究与分析
摘要：脱落酸、 胁迫、 成熟相关蛋白（Abscisic acid stress ripening proteins， ASR）是 一 类 植物特异性小分子量亲水性蛋白家族， 其组氨酸、谷氨酸及赖氨酸含量很高。以巨峰葡萄为试验材料，在克隆葡萄ASR基因的基础上，对葡萄的ASR基因进行生物信息学、时空表达分析，通过调控瞬时表达番茄果实中ASR基因的表达水平，分析果实着色、蔗糖、ABA、花色苷、果实硬度等生理指标的变化，揭示ASR基因控制果实成熟。ASRs基因在葡萄中已提出它们既作为具有直接保护作用的高度亲水性蛋白质参与了在植物对环境诱因的响应，也作为转录因子调控着基因表达，具有双重作用。本文主要研究的内容包括葡萄ASR基因的克隆、ASR基因组的表达分析以及ASR基因功能的分析。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法2
1.2.1 葡萄中ASR基因的克隆及鉴定3
1.2.2 基因表达分析3
1.2.3 载体构建3
1.2.4 杆菌侵染葡萄果实3
1.2.5 果实色素、硬度、糖、可溶性固形物等生理参数的测定3
2 结果与分析4
2.1 ASR基因的克隆4
2.2 葡萄中ASR基因表达分析4
2.3 ASR基因的表达对葡萄果实发育的影响5
3 讨论6
致谢8
参考文献9
葡萄ASR基因功能的研究与分析
引言
ASR蛋白是由小的多基因家族编码的，Iusem等最早从番茄中分离得到第1个ASR蛋白，之后30多种不同植物中的ASR基因被确定，但在拟南芥中并未发现有ASR模式的基因，现在水稻中已被鉴定有6个成员，在番茄、松树和香蕉中各有4个[1]。它们的特征是体积小，碱性蛋白质含量高和亲水性强，一些碱性蛋白能与DNA结合，亚细胞定位及免疫检测结果表明番茄ASR1作为转录因子时定位于细胞核中。作为分子伴侣时定位于细胞质中。ASR家族不同成员在不同器官及条件下的表达特性各不相
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
同。几乎所有已知的ASR基因包含两个高度保守的区域，第一区包含6、7组氨基酸残基的短的N末端，其伸展可能构成一个锌结合位点，第二区是一个C末端区域的很大一部分。在不同物种中，ASR基因在不同器官中表达，如番茄，柚子，杏的果实中；西红柿、水稻、松树、玉米的根和叶中；马铃薯的块茎中；百合的花粉中[2]等等。很多研究已报道了不同植物种类中ASR蛋白在各种非生物胁迫如缺水、缺盐、冷害以及渗透胁迫下的作用，玉米的克隆ASR基因连接于抗旱性。香蕉的4个ASR基因在分生组织、根、假茎、叶和球茎中均有表达，但在分生组织中，mAsr1和 mAsr3的表达受渗透胁迫的诱导，而mAsr3和mAsr4的 表达受外源ABA诱导；百合中LLA23的表达受ABA、盐和干旱的诱导；在拟南芥中该基因的过表达使植株表现出了很强的抗干旱胁迫和盐胁迫的能力，证明了该基因在胁迫响应中的作用；在烟草中番茄Asr1基因的过表达提高了植株对高盐的抗性，同时也调控其它基因的表达：另一个ASR蛋白CI21A/ASR1被证明参与在马铃薯块茎中糖代谢的调节。低分子量的ASRs的亲水性高，可以设计它们作为直接的蛋白质保护，像一些LEA蛋白，此外它们的优先核定位和直接互动DNA建议作为转录调节的基因表达，然而这些生物功能蛋白质仍然下落不明。
与本课题研究相关的葡萄中1个命名为VvMSA的ASR基因主要在成熟期表达受蔗糖和ABA信号的诱导，由酵母单杂交方法，使用作为目标的基葡萄糖转运蛋白基因VvHT1的启动，分离出了葡萄ASR基因评为VvMSA，VvMSA蛋白直接结合该VvHT1启动子显示出在凝胶移位测定和确认通过在植物中的共表达实验，在这项工作中，表现出葡萄的某些多态性的ASRs在cDNA和蛋白质水平其识别作为染色体非组蛋白。利用酵母双杂交筛选，发现葡萄ASR的蛋白质寻找共同作用因子的特点，它作为一个AP2结构域，转录因子命名为VvDREB（葡萄干旱反应元件结合蛋白），这两种蛋白质之间的相互作用是表现在葡萄细胞双分子荧光互补中，并专门定位于细胞核这些设计葡萄ASRs作为转录因子的模型能够引起另一个调节蛋白如VvDREB基因的表达。据Journal of Experimental Botany的一篇研究报告，来自法国的研究人员研究了葡萄 ASR脱落酸（ABA）、胁迫、成熟转录调控及其对葡萄糖、脱落酸的响应[3]。
ASR基因也可以参与植物的生长发育过程，如种子和花粉发芽，叶片衰老和果实成熟，果实成熟是一个十分复杂的发育过程，其中包括成熟相关特定基因的表达和果实细胞代谢的特定变化。果实成熟与糖代谢转运密不可分，糖与ABA的积累趋势大体一致，ASR基因转录是糖和ABA代谢联系的信号[4]。我们前期的研究表明ABA是调控葡萄果实成熟的主要因素，而且蔗糖也可以作为一个信号组分调控葡萄果实的发育成熟进程，蔗糖可以依赖ABA路径或者非依赖ABA路径来调控葡萄果实发育成熟，而ASR基因参与蔗糖及ABA信号路径，但其参与果实发育成熟的具体的调节和响应机制还不清楚，以及如何参与了糖及ABA信号转导路径来调控基因的转录水平也不清楚。我们目前的工作已经分离葡萄果实中ASR基因，果实的成熟是有一个复杂的信号网络调控，ASR基因功能的鉴定可为完善信号网络奠定基础。
葡萄不仅属于典型的非呼吸跃变型果实，而且由于其基因组相对较小，遗传转化方便等优点，目前已经成为果树分子生物学研究的理想试材。尤其是葡萄中基因瞬表达体系的建立为快速鉴定基因的功能提供了可能，基于此，拟开展以下研究：通过瞬时调控 ASR 基因在葡萄果实中的表达，分析其对葡萄果实发育的影响，本研究不但对植物生命科学具有重要的理论意义，而且对果品产业的发展具有一定的实践指导意义。
1 材料与方法
1．1 材料
本研究拟以大学葡萄实验基地的葡萄品种巨峰为材料，葡萄生长状况良好，在葡萄第一次开花时做标记，定期采果。试材大小一致，均为发育一致同期的果实。采集花后不同时期的果实：座果期（花后10d）；转色前（花后40d）；转色时（花后60d）；成熟期（花后80d）；采收前（花后90d）。对样品的采集应选同株同一时期的葡萄的根、茎、叶、花、果实，组织表达样品的采集，所选取的每个时期葡萄样品设置3个重复。摘取鲜样后立即用无菌的锋利刀片将果肉和种子分离，收集果肉液氮速冻，贮存于80℃超低温冰箱中待用。
1．2 方法
1．2．1 葡萄中ASR基因的克隆及鉴定 本研究拟采用Promega的植物总RNA提取试剂盒和本研究室成功改良的CTAB法提取植物总RNA的方法相结合来提取葡萄果肉和各个组织的总RNA。根据说明书，使用RNA反转通用引物(5GACTAGTTTTGAT CACCACCAC3；5CCGGAATTCAA－CATCAAACTATAATC3)合成cDNA。通过Southern blot杂交技术来确定ASR基因在葡萄果实中的拷贝数。
1．2．2 基因表达分析 采用Realtime PCR的方法。荧光定量分析基因表达量：总RNA的提取和处理如上所述，3μg总RNA反转成100μL cDNA用于荧光定量分析基因的表达量，葡萄Actin基因用做内参，反应内容如下：反应总体系为20μl，包括10μLSYBR Premix Ex Taq（TaKaRa)，0.4μL上游引物（10μm），0.4μL下游引物（10μm），和2μLcDNA。混合物放置于BioRad iQ荧光定量PCR仪中反应。95℃一个循环2分钟，94℃变性20s，56℃复性20s，72℃延伸30s总共40个循环从60℃到95℃每隔0.5℃溶解30s，总共71个循环。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法2
1.2.1 葡萄中ASR基因的克隆及鉴定3
1.2.2 基因表达分析3
1.2.3 载体构建3
1.2.4 杆菌侵染葡萄果实3
1.2.5 果实色素、硬度、糖、可溶性固形物等生理参数的测定3
2 结果与分析4
2.1 ASR基因的克隆4
2.2 葡萄中ASR基因表达分析4
2.3 ASR基因的表达对葡萄果实发育的影响5
3 讨论6
致谢8
参考文献9
葡萄ASR基因功能的研究与分析
引言
ASR蛋白是由小的多基因家族编码的，Iusem等最早从番茄中分离得到第1个ASR蛋白，之后30多种不同植物中的ASR基因被确定，但在拟南芥中并未发现有ASR模式的基因，现在水稻中已被鉴定有6个成员，在番茄、松树和香蕉中各有4个[1]。它们的特征是体积小，碱性蛋白质含量高和亲水性强，一些碱性蛋白能与DNA结合，亚细胞定位及免疫检测结果表明番茄ASR1作为转录因子时定位于细胞核中。作为分子伴侣时定位于细胞质中。ASR家族不同成员在不同器官及条件下的表达特性各不相
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
同。几乎所有已知的ASR基因包含两个高度保守的区域，第一区包含6、7组氨基酸残基的短的N末端，其伸展可能构成一个锌结合位点，第二区是一个C末端区域的很大一部分。在不同物种中，ASR基因在不同器官中表达，如番茄，柚子，杏的果实中；西红柿、水稻、松树、玉米的根和叶中；马铃薯的块茎中；百合的花粉中[2]等等。很多研究已报道了不同植物种类中ASR蛋白在各种非生物胁迫如缺水、缺盐、冷害以及渗透胁迫下的作用，玉米的克隆ASR基因连接于抗旱性。香蕉的4个ASR基因在分生组织、根、假茎、叶和球茎中均有表达，但在分生组织中，mAsr1和 mAsr3的表达受渗透胁迫的诱导，而mAsr3和mAsr4的 表达受外源ABA诱导；百合中LLA23的表达受ABA、盐和干旱的诱导；在拟南芥中该基因的过表达使植株表现出了很强的抗干旱胁迫和盐胁迫的能力，证明了该基因在胁迫响应中的作用；在烟草中番茄Asr1基因的过表达提高了植株对高盐的抗性，同时也调控其它基因的表达：另一个ASR蛋白CI21A/ASR1被证明参与在马铃薯块茎中糖代谢的调节。低分子量的ASRs的亲水性高，可以设计它们作为直接的蛋白质保护，像一些LEA蛋白，此外它们的优先核定位和直接互动DNA建议作为转录调节的基因表达，然而这些生物功能蛋白质仍然下落不明。
与本课题研究相关的葡萄中1个命名为VvMSA的ASR基因主要在成熟期表达受蔗糖和ABA信号的诱导，由酵母单杂交方法，使用作为目标的基葡萄糖转运蛋白基因VvHT1的启动，分离出了葡萄ASR基因评为VvMSA，VvMSA蛋白直接结合该VvHT1启动子显示出在凝胶移位测定和确认通过在植物中的共表达实验，在这项工作中，表现出葡萄的某些多态性的ASRs在cDNA和蛋白质水平其识别作为染色体非组蛋白。利用酵母双杂交筛选，发现葡萄ASR的蛋白质寻找共同作用因子的特点，它作为一个AP2结构域，转录因子命名为VvDREB（葡萄干旱反应元件结合蛋白），这两种蛋白质之间的相互作用是表现在葡萄细胞双分子荧光互补中，并专门定位于细胞核这些设计葡萄ASRs作为转录因子的模型能够引起另一个调节蛋白如VvDREB基因的表达。据Journal of Experimental Botany的一篇研究报告，来自法国的研究人员研究了葡萄 ASR脱落酸（ABA）、胁迫、成熟转录调控及其对葡萄糖、脱落酸的响应[3]。
ASR基因也可以参与植物的生长发育过程，如种子和花粉发芽，叶片衰老和果实成熟，果实成熟是一个十分复杂的发育过程，其中包括成熟相关特定基因的表达和果实细胞代谢的特定变化。果实成熟与糖代谢转运密不可分，糖与ABA的积累趋势大体一致，ASR基因转录是糖和ABA代谢联系的信号[4]。我们前期的研究表明ABA是调控葡萄果实成熟的主要因素，而且蔗糖也可以作为一个信号组分调控葡萄果实的发育成熟进程，蔗糖可以依赖ABA路径或者非依赖ABA路径来调控葡萄果实发育成熟，而ASR基因参与蔗糖及ABA信号路径，但其参与果实发育成熟的具体的调节和响应机制还不清楚，以及如何参与了糖及ABA信号转导路径来调控基因的转录水平也不清楚。我们目前的工作已经分离葡萄果实中ASR基因，果实的成熟是有一个复杂的信号网络调控，ASR基因功能的鉴定可为完善信号网络奠定基础。
葡萄不仅属于典型的非呼吸跃变型果实，而且由于其基因组相对较小，遗传转化方便等优点，目前已经成为果树分子生物学研究的理想试材。尤其是葡萄中基因瞬表达体系的建立为快速鉴定基因的功能提供了可能，基于此，拟开展以下研究：通过瞬时调控 ASR 基因在葡萄果实中的表达，分析其对葡萄果实发育的影响，本研究不但对植物生命科学具有重要的理论意义，而且对果品产业的发展具有一定的实践指导意义。
1 材料与方法
1．1 材料
本研究拟以大学葡萄实验基地的葡萄品种巨峰为材料，葡萄生长状况良好，在葡萄第一次开花时做标记，定期采果。试材大小一致，均为发育一致同期的果实。采集花后不同时期的果实：座果期（花后10d）；转色前（花后40d）；转色时（花后60d）；成熟期（花后80d）；采收前（花后90d）。对样品的采集应选同株同一时期的葡萄的根、茎、叶、花、果实，组织表达样品的采集，所选取的每个时期葡萄样品设置3个重复。摘取鲜样后立即用无菌的锋利刀片将果肉和种子分离，收集果肉液氮速冻，贮存于80℃超低温冰箱中待用。
1．2 方法
1．2．1 葡萄中ASR基因的克隆及鉴定 本研究拟采用Promega的植物总RNA提取试剂盒和本研究室成功改良的CTAB法提取植物总RNA的方法相结合来提取葡萄果肉和各个组织的总RNA。根据说明书，使用RNA反转通用引物(5GACTAGTTTTGAT CACCACCAC3；5CCGGAATTCAA－CATCAAACTATAATC3)合成cDNA。通过Southern blot杂交技术来确定ASR基因在葡萄果实中的拷贝数。
1．2．2 基因表达分析 采用Realtime PCR的方法。荧光定量分析基因表达量：总RNA的提取和处理如上所述，3μg总RNA反转成100μL cDNA用于荧光定量分析基因的表达量，葡萄Actin基因用做内参，反应内容如下：反应总体系为20μl，包括10μLSYBR Premix Ex Taq（TaKaRa)，0.4μL上游引物（10μm），0.4μL下游引物（10μm），和2μLcDNA。混合物放置于BioRad iQ荧光定量PCR仪中反应。95℃一个循环2分钟，94℃变性20s，56℃复性20s，72℃延伸30s总共40个循环从60℃到95℃每隔0.5℃溶解30s，总共71个循环。
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