葡萄未知功能基因的克隆与功能研究
摘要：葡萄(Vitis vinifera L.)是世界上栽培面积最大的果树树种之一。但其基因组庞大，果实发育成熟机理极其复杂。通过高通量测序，我们已经了解葡萄基因组的奥妙，通过基因工程手段利用葡萄来丰富人们的生活。葡萄已经进行了全基因组测序，但大部分基因的功能仍处于未知阶段。为此本研究以葡萄未知基因为突破口，发现了未知基因的蛋白序列功能区的线粒体转录终止因子(mTERF)蛋白家族，并对其功能进行了分析验证，为葡萄基因功能的注释和研究葡萄发育提供参考和基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 引言 1
1．1 葡萄转录组学 2
1．2 高通量测序技术的应用 2
1．2．1 高通量测序技术 2
1．2．2 高通量RNA测序在转录组和基因表达调控研究中的应用 2
1. 3 果实发育相关基因的探究 3
2 材料与方法 3
2．1 材料 3
2．2 方法 3
2．2．1 葡萄果实RNA提取 3
2．2．2 未知基因的克隆 3
2．2．3 荧光定量 3
2．2．4 载体构建 3
2．2．5 农杆菌感受态细胞的制备 4
2．2．6 转化农杆菌 4
2．2．7 烟草转基因 5
3 结果与分析 5
3．1 未知基因的克隆 5
3．2 未知基因的分析 5
3．3 未知基因表达量的分析 6
3. 4 烟草转基因分析 6
4 讨论 8
4．1 线粒体转录终止因子(mTERF)蛋白家族对葡萄果实发育的影响 8
4．1．1 线粒体转录终止因子(mTERF)蛋白家族对葡萄果实发育起调控作用 8
4．1．2 线粒体转录终止因子(mTERF)蛋白家族对葡萄植株抗旱能力的影响 8
4．2 线粒体转录终止因子(mTERF)蛋白家族在植物育种中的应用 8
4．2．1 线粒体转录终止因子(mTE
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
RF)蛋白家族对果实生长的调节作用 8
4．2．2 线粒体转录终止因子(mTERF)蛋白家族对葡萄的抗逆作用 9
4．3 农杆菌侵染烟草叶片条件的掌控 9
致谢 9
参考文献 9
葡萄未知功能基因的克隆与研究
引言
1 引言
葡萄（Vitis vinifera L.），葡萄科（Vitaceae）葡萄属（Vitis L.），藤本植物，是世界上广泛栽培的具有重要经济价值的作物，可用于生食、制葡萄干及酿酒等。葡萄浆果为非呼吸跃变型，大多数葡萄种的染色体数为2n=2x=38,是第1种被测序的果树类双子叶植物[1]。在葡萄基因组中有许多有关葡萄生长与发育、果实的质量与产量、抗病虫、抗胁迫和对环境的适应相关基因，如亮氨酸拉链和bZIP类结合蛋白等。
高通量测序技术的迅猛发展，将基因组学水平的研究带入了一个新的时期，也使经典分子生物科学家对基因组学的认识和思考上升到一个新的水平。高通量测序技术不仅可以进行大规模基因组测序，还可用于基因表达分析、非编码小分子RNA的鉴定、转录因子靶基因的筛选和DNA甲基化等相关研究。本研究通过将高通量测序技术对葡萄转录组分析，在测序结果中发现大量功能未知基因。并且本实验拟采用对这些未知功能基因进行克隆及农杆菌介导烟草转化技术手段，来验证其功能，从而在分子水平上更深入认识葡萄基因功能，为今后通过转基因等手段提高葡萄果实品质、抗性等相关研究提供理论依据。
1．1 葡萄转录组学
葡萄属于非呼吸跃变型果实，存在2个迅速生长期。果实成熟包括各种不同的生物学过程，例如细胞分裂与生长、初级与次生代谢以及各种生物与非生物胁迫等。
转录组，指细胞内所有转录产物之和，包括mRNA和ncRNA[2]。转录组测序与全基因组测序相比，转录组测序所需成本低，数据分析方面更简单，其余各方面也优于全基因组测序[3]。因此在本研究中，采用的是转录组测序数据。
da Silva等根据拟南芥的同源蛋白基因和葡萄相关方面的研究，将葡萄从开花到果实完全成熟全程的87个不同表达基因归为八个功能组，这八个功能组涵盖了葡萄果实生长、代谢、病程相关、胁迫和氧化还原等方面[4]。
Grimplet等[5]全面研究了葡萄成熟果粒的3种组织（表皮、果肉和种子）的mRNA表达。研究表明，在转录水平上，葡萄果实组织特异基因表达的网络结构。经过葡萄微阵列分析，表明在DNA水平上，超过一半的基因会在浆果组织中表达。
通过研究葡萄果粒成熟过程的不同阶段的基因表达情况，葡萄果粒成熟有两个明显区分的时期：转熟期前，果实处于细胞代谢阶段，其关联到激素信号和转录调控等大量基因的表达；在前段时期过后，基因表达主要方面为成熟果实表型特征相关的果实成熟特异代谢。并且在转熟期，存在氧化爆发和抗氧化酶网络的拮抗作用[6]。目前虽然对葡萄的许多基因功能进行了分类以及在转录水平上弄清了葡萄果实组织特异基因表达的网络结构，但仍然存在大量未知功能基因有待验证，对这些未知功能基因的探索将成为葡萄转录组学研究的重要部分，为今后葡萄种间乃至其他物种分子遗传育种提供理论依据。
1．2 高通量测序技术的应用
1．2．1 高通量测序技术
高通量测序技术能够同时对上百万个DNA分子进行测序，其极高的工作效率足以完成对一个物种的转录组和基因组进行深入详细的分析，因此也称其为深度测序(deep sequencing)或下一代测序技术(next generation sequencing，NGS)。高通量测序技术有三个特别之处：其一，高通量测序能够多线程地同时对上百万个DNA分子测序，高效快速，因此也称之为大规模平行测序(massively parallel signature sequencing，MPSS)；第二，它具有出色的定量功能，这是因为样品中某种DNA被测序的次数反映了样品中这种DNA的丰度。其三，高通量测序的花费较少。在传统的测序发中，需要耗费大量的财力，但高通量测序耗资远远低于传统测序法。
1．2．2 高通量RNA测序在转录组和基因表达调控研究中的应用
高通量测序技术在实验操作中具有两大优势。首先，它采用芯片测序，可以对数百万计的点上进行同时的测序工作，这种方式被认为是平行处理，多线程进行测序；其二，高通量测序具有定量的功能，这是通过了解DNA被测序的次数来获得的[7]。
RNA（RNASeq）测序是高通量测序应用于转录组分析的一种手段，转录组的研究为后续的基因功能和结构研究作前期准备。由于RNASeq技术在应用过程中各项表现出色，该技术目前大量应用在生物转录组的研究当中。同时，我国在应用RNASeq进行水稻转录谱分析方面走在了世界的前列，在这方面有较多的经验[8]。
对于本次实验中所研究的果实成熟相关基因，果实在成熟过程中的一系列变化是控制相关性状的基因开启或关闭而产生的。在果树中，现已有对甜樱桃、黑树莓等果树的转录组进行测序，了解到与果实成熟关系密切的基因及其所编码的蛋白质，在分子机理层面对果树成熟的生理变化进行解释[9]。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 引言 1
1．1 葡萄转录组学 2
1．2 高通量测序技术的应用 2
1．2．1 高通量测序技术 2
1．2．2 高通量RNA测序在转录组和基因表达调控研究中的应用 2
1. 3 果实发育相关基因的探究 3
2 材料与方法 3
2．1 材料 3
2．2 方法 3
2．2．1 葡萄果实RNA提取 3
2．2．2 未知基因的克隆 3
2．2．3 荧光定量 3
2．2．4 载体构建 3
2．2．5 农杆菌感受态细胞的制备 4
2．2．6 转化农杆菌 4
2．2．7 烟草转基因 5
3 结果与分析 5
3．1 未知基因的克隆 5
3．2 未知基因的分析 5
3．3 未知基因表达量的分析 6
3. 4 烟草转基因分析 6
4 讨论 8
4．1 线粒体转录终止因子(mTERF)蛋白家族对葡萄果实发育的影响 8
4．1．1 线粒体转录终止因子(mTERF)蛋白家族对葡萄果实发育起调控作用 8
4．1．2 线粒体转录终止因子(mTERF)蛋白家族对葡萄植株抗旱能力的影响 8
4．2 线粒体转录终止因子(mTERF)蛋白家族在植物育种中的应用 8
4．2．1 线粒体转录终止因子(mTE
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
RF)蛋白家族对果实生长的调节作用 8
4．2．2 线粒体转录终止因子(mTERF)蛋白家族对葡萄的抗逆作用 9
4．3 农杆菌侵染烟草叶片条件的掌控 9
致谢 9
参考文献 9
葡萄未知功能基因的克隆与研究
引言
1 引言
葡萄（Vitis vinifera L.），葡萄科（Vitaceae）葡萄属（Vitis L.），藤本植物，是世界上广泛栽培的具有重要经济价值的作物，可用于生食、制葡萄干及酿酒等。葡萄浆果为非呼吸跃变型，大多数葡萄种的染色体数为2n=2x=38,是第1种被测序的果树类双子叶植物[1]。在葡萄基因组中有许多有关葡萄生长与发育、果实的质量与产量、抗病虫、抗胁迫和对环境的适应相关基因，如亮氨酸拉链和bZIP类结合蛋白等。
高通量测序技术的迅猛发展，将基因组学水平的研究带入了一个新的时期，也使经典分子生物科学家对基因组学的认识和思考上升到一个新的水平。高通量测序技术不仅可以进行大规模基因组测序，还可用于基因表达分析、非编码小分子RNA的鉴定、转录因子靶基因的筛选和DNA甲基化等相关研究。本研究通过将高通量测序技术对葡萄转录组分析，在测序结果中发现大量功能未知基因。并且本实验拟采用对这些未知功能基因进行克隆及农杆菌介导烟草转化技术手段，来验证其功能，从而在分子水平上更深入认识葡萄基因功能，为今后通过转基因等手段提高葡萄果实品质、抗性等相关研究提供理论依据。
1．1 葡萄转录组学
葡萄属于非呼吸跃变型果实，存在2个迅速生长期。果实成熟包括各种不同的生物学过程，例如细胞分裂与生长、初级与次生代谢以及各种生物与非生物胁迫等。
转录组，指细胞内所有转录产物之和，包括mRNA和ncRNA[2]。转录组测序与全基因组测序相比，转录组测序所需成本低，数据分析方面更简单，其余各方面也优于全基因组测序[3]。因此在本研究中，采用的是转录组测序数据。
da Silva等根据拟南芥的同源蛋白基因和葡萄相关方面的研究，将葡萄从开花到果实完全成熟全程的87个不同表达基因归为八个功能组，这八个功能组涵盖了葡萄果实生长、代谢、病程相关、胁迫和氧化还原等方面[4]。
Grimplet等[5]全面研究了葡萄成熟果粒的3种组织（表皮、果肉和种子）的mRNA表达。研究表明，在转录水平上，葡萄果实组织特异基因表达的网络结构。经过葡萄微阵列分析，表明在DNA水平上，超过一半的基因会在浆果组织中表达。
通过研究葡萄果粒成熟过程的不同阶段的基因表达情况，葡萄果粒成熟有两个明显区分的时期：转熟期前，果实处于细胞代谢阶段，其关联到激素信号和转录调控等大量基因的表达；在前段时期过后，基因表达主要方面为成熟果实表型特征相关的果实成熟特异代谢。并且在转熟期，存在氧化爆发和抗氧化酶网络的拮抗作用[6]。目前虽然对葡萄的许多基因功能进行了分类以及在转录水平上弄清了葡萄果实组织特异基因表达的网络结构，但仍然存在大量未知功能基因有待验证，对这些未知功能基因的探索将成为葡萄转录组学研究的重要部分，为今后葡萄种间乃至其他物种分子遗传育种提供理论依据。
1．2 高通量测序技术的应用
1．2．1 高通量测序技术
高通量测序技术能够同时对上百万个DNA分子进行测序，其极高的工作效率足以完成对一个物种的转录组和基因组进行深入详细的分析，因此也称其为深度测序(deep sequencing)或下一代测序技术(next generation sequencing，NGS)。高通量测序技术有三个特别之处：其一，高通量测序能够多线程地同时对上百万个DNA分子测序，高效快速，因此也称之为大规模平行测序(massively parallel signature sequencing，MPSS)；第二，它具有出色的定量功能，这是因为样品中某种DNA被测序的次数反映了样品中这种DNA的丰度。其三，高通量测序的花费较少。在传统的测序发中，需要耗费大量的财力，但高通量测序耗资远远低于传统测序法。
1．2．2 高通量RNA测序在转录组和基因表达调控研究中的应用
高通量测序技术在实验操作中具有两大优势。首先，它采用芯片测序，可以对数百万计的点上进行同时的测序工作，这种方式被认为是平行处理，多线程进行测序；其二，高通量测序具有定量的功能，这是通过了解DNA被测序的次数来获得的[7]。
RNA（RNASeq）测序是高通量测序应用于转录组分析的一种手段，转录组的研究为后续的基因功能和结构研究作前期准备。由于RNASeq技术在应用过程中各项表现出色，该技术目前大量应用在生物转录组的研究当中。同时，我国在应用RNASeq进行水稻转录谱分析方面走在了世界的前列，在这方面有较多的经验[8]。
对于本次实验中所研究的果实成熟相关基因，果实在成熟过程中的一系列变化是控制相关性状的基因开启或关闭而产生的。在果树中，现已有对甜樱桃、黑树莓等果树的转录组进行测序，了解到与果实成熟关系密切的基因及其所编码的蛋白质，在分子机理层面对果树成熟的生理变化进行解释[9]。
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