王林‘orin’苹果叶片高效离体再生体系的建
本实验以苹果品种‘王林’为实验试材，研究不同激素质量浓度和外植体类型对不定芽再生频率的影响。结果表明，最适合‘王林’不定芽再生培养基为MS+TDZ 3 mg/L+NAA 0.8 mg/L+琼脂5 g/L+蔗糖30 g/L；叶片较适宜作为不定芽再生的外植体。研究初步建立了‘王林’苹果的离体不定芽高效再生技术，在最适培养基中‘王林’苹果叶片的再生频率可达到56.0%，平均每个外植体再生芽数为2.64。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2实验方法 2
1.2.1 无菌苗的获得2
1.2.2 外植体的制备2
1.2.3 TDZ、6BA和NAA的激素组合2
1.2.4 再生苗的生根3
1.3数据统计方法3
2 结果与分析3
2.1组织愈伤及不定芽发生动态 3
2.2不同接种部位对‘王林’再生的影响 3
2.3不同激素组合对叶片不定芽再生的影响3
2.4不同激素组合对叶柄不定芽再生的影响 4
2.5再生苗的生根培养 4
3讨论8
4结论9
致谢9
参考文献9
图15
图26
图36
表11 7
王林‘Orin’苹果叶片高效离体再生体系的建立
引言
引言：苹果(Malus domestica Borkh.)是蔷薇科(Rosaceae)苹果属(Malus)多年生木本植物，是世界主要的栽培果树树种之一。作为世界四大水果之一，在我国栽培面积、产量和消费水平位也居水果之首。苹果与其他木本植物一样，生长周期长、遗传背景复杂，给传统的杂交育种造成很多困难。近年来，为了进一步提高苹果的抗病性、抗虫性、抗逆性等，采用基因工程技术改良苹果的遗传特性，为苹果遗传育种提供了新技术，加快了苹果新品种的育种过程。但是在基因转化中，良好的再 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
生体系是必不可少的，它是决定基因转化成败的关键[1]。因此，建立高效、稳定的苹果离体再生体系十分重要。从20世纪80年代开始就有苹果快繁体系和高频植株再生的研究，随着人们对苹果离体再生植株影响因素及其生理机制等的研究不断深入，已经得到了许多苹果品种的稳定高效再生体系，如‘澳洲青苹’[2]、‘乔纳金’[3]、‘富士’[4]、‘昌红’[5]、‘嘎拉’[6]、‘宫藤’富士[7]、‘新红星’[8]、‘长富6号’[9]、‘红将军’[10]、‘华富’苹果[11]、‘鲁加16号’[12]等。
建立苹果的再生体系虽有报道，但不同基因型间再生频率差异较大，且其再生体系各不相同。‘王林’苹果品种是由日本福岛县金冠与印度杂交选育而成，是上等品质的品种。‘王林’也是黄色优质品种，适应性强，果实较耐储藏，适宜作为富士系品种的授粉品种。本实验以‘王林’苹果为研究对象，研究6BA、TDZ和NAA不同浓度配比组合、不同外植体类型对不定芽再生的影响，从而建立稳定的离体再生体系，并且诱导再生植株的生根，为农杆菌介导‘王林’苹果的遗传转化提供了基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验材料为山西省某苹果园的‘王林’苹果田间苗上剪取l年生休眠枝条。选用苹果品种‘王林’无菌组培苗为材料，供试组培苗在MS+0.5 mg/L 6BA＋0.1 mg/L NAA的培养基上继代培养，组培苗在相同的培养基上每隔30~50 d继代一次。选取组培苗顶部幼嫩、平展的叶片，作为实验备用。
1.2 实验方法
1.2.1 无菌苗的获得 将枝条放在组培室进行水培，待新稍发出后，取刚萌发的芽，剥去鳞片，把展开的叶片去除，切下的芽用流水冲洗1 h后，置于无菌三角瓶中。在超净工作台上先用75%的酒精浸泡20 s后用无菌水冲洗3遍，再用0.1%的升汞消毒8 min后，用无菌水冲洗5遍(冲洗过程中不断摇动)，然后用灭菌吸水纸吸干外植体表面液体，将外植体接种于MS+6BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基中转入光照培养。培养40 d后的外植体转到上述新鲜的培养基中继续培养。试验中所用的培养基灭菌都采用高压灭菌的方式，培养室的光照条件为16 h/d，温度为2325 ℃，光照强度为20003000 lx。
1.2.2 外植体的制备 取苗龄为2835 d的试管苗，剪取顶部2~4片幼嫩平展的叶片，形状色泽基本一致，使外植体在生理状态上基本保持一致。每张片剪去叶尖和叶缘，再沿垂直于主脉的方向将叶片剪成长宽均约为3 cm的2~3段，将叶片外植体近轴面（叶正面朝下）接种在再生诱导分化培养基上[12][13]，每个培养瓶中接种10个叶块，每个处理重复3次。
取继代培养28~35 d的‘王林’苹果试管苗的叶柄，切成大小均匀的片段，接种于再生培养上，每个培养瓶中接种10个，每个重复2次。
1.2.3 TDZ、6BA和NAA激素组合 分化培养基的基本培养基为MS培养基，附加蔗糖30.0 g/L、琼脂6.0 g/L，分别添加不同浓度的激素组合。在6BA与NAA的组合中，6BA浓度设3种水平(2.0 mg/L、4.0 mg/L、6.0 mg/L)，在每一种6BA浓度组合中，NAA浓度设6个水平(0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.7 mg/L、0.8 mg/L)，共计18个组合；在TDZ和NAA组合处理中，TDZ浓度设3种水平（1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L），每个TDZ浓度下，NAA设同上述的6个水平(TDZ浓度为5.0 mg/L 时，NAA浓度只设0.1 mg/L、0.4 mg/L、0.7 mg/L)，共15个组合。培养基在121 ℃下灭菌20 min。接种结束后进行20 d的暗培养，然后移置于培养架上进行光照培养。接种40 d和50 d后进行叶片和叶柄不定芽再生频率的统计。
1.2.4 再生苗的生根 取生长健壮的再生苗2~3 cm的带芽茎段接种在生根培养基中，进行14 d暗培养后放置于光照条件为16 h/d，温度为2325 ℃，光照强度为20003000 lx培养架上进行光照培养，诱导其生根。
1.3 数据统计方法
外植体接种分别在40 d和50 d后对再生效率进行调查。按下列公式计算不定芽再生频率和平均外植体再生芽数：
不定芽再生频率(%)=再生不定芽的外植体数/接种外植体数×100%
平均每个外植体再生芽数=再生芽总数/再生芽的外植体总数
生根率(%)=生根株数/调查株数×100%
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摘要1
关键词1
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Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2实验方法 2
1.2.1 无菌苗的获得2
1.2.2 外植体的制备2
1.2.3 TDZ、6BA和NAA的激素组合2
1.2.4 再生苗的生根3
1.3数据统计方法3
2 结果与分析3
2.1组织愈伤及不定芽发生动态 3
2.2不同接种部位对‘王林’再生的影响 3
2.3不同激素组合对叶片不定芽再生的影响3
2.4不同激素组合对叶柄不定芽再生的影响 4
2.5再生苗的生根培养 4
3讨论8
4结论9
致谢9
参考文献9
图15
图26
图36
表11 7
王林‘Orin’苹果叶片高效离体再生体系的建立
引言
引言：苹果(Malus domestica Borkh.)是蔷薇科(Rosaceae)苹果属(Malus)多年生木本植物，是世界主要的栽培果树树种之一。作为世界四大水果之一，在我国栽培面积、产量和消费水平位也居水果之首。苹果与其他木本植物一样，生长周期长、遗传背景复杂，给传统的杂交育种造成很多困难。近年来，为了进一步提高苹果的抗病性、抗虫性、抗逆性等，采用基因工程技术改良苹果的遗传特性，为苹果遗传育种提供了新技术，加快了苹果新品种的育种过程。但是在基因转化中，良好的再 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
生体系是必不可少的，它是决定基因转化成败的关键[1]。因此，建立高效、稳定的苹果离体再生体系十分重要。从20世纪80年代开始就有苹果快繁体系和高频植株再生的研究，随着人们对苹果离体再生植株影响因素及其生理机制等的研究不断深入，已经得到了许多苹果品种的稳定高效再生体系，如‘澳洲青苹’[2]、‘乔纳金’[3]、‘富士’[4]、‘昌红’[5]、‘嘎拉’[6]、‘宫藤’富士[7]、‘新红星’[8]、‘长富6号’[9]、‘红将军’[10]、‘华富’苹果[11]、‘鲁加16号’[12]等。
建立苹果的再生体系虽有报道，但不同基因型间再生频率差异较大，且其再生体系各不相同。‘王林’苹果品种是由日本福岛县金冠与印度杂交选育而成，是上等品质的品种。‘王林’也是黄色优质品种，适应性强，果实较耐储藏，适宜作为富士系品种的授粉品种。本实验以‘王林’苹果为研究对象，研究6BA、TDZ和NAA不同浓度配比组合、不同外植体类型对不定芽再生的影响，从而建立稳定的离体再生体系，并且诱导再生植株的生根，为农杆菌介导‘王林’苹果的遗传转化提供了基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验材料为山西省某苹果园的‘王林’苹果田间苗上剪取l年生休眠枝条。选用苹果品种‘王林’无菌组培苗为材料，供试组培苗在MS+0.5 mg/L 6BA＋0.1 mg/L NAA的培养基上继代培养，组培苗在相同的培养基上每隔30~50 d继代一次。选取组培苗顶部幼嫩、平展的叶片，作为实验备用。
1.2 实验方法
1.2.1 无菌苗的获得 将枝条放在组培室进行水培，待新稍发出后，取刚萌发的芽，剥去鳞片，把展开的叶片去除，切下的芽用流水冲洗1 h后，置于无菌三角瓶中。在超净工作台上先用75%的酒精浸泡20 s后用无菌水冲洗3遍，再用0.1%的升汞消毒8 min后，用无菌水冲洗5遍(冲洗过程中不断摇动)，然后用灭菌吸水纸吸干外植体表面液体，将外植体接种于MS+6BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基中转入光照培养。培养40 d后的外植体转到上述新鲜的培养基中继续培养。试验中所用的培养基灭菌都采用高压灭菌的方式，培养室的光照条件为16 h/d，温度为2325 ℃，光照强度为20003000 lx。
1.2.2 外植体的制备 取苗龄为2835 d的试管苗，剪取顶部2~4片幼嫩平展的叶片，形状色泽基本一致，使外植体在生理状态上基本保持一致。每张片剪去叶尖和叶缘，再沿垂直于主脉的方向将叶片剪成长宽均约为3 cm的2~3段，将叶片外植体近轴面（叶正面朝下）接种在再生诱导分化培养基上[12][13]，每个培养瓶中接种10个叶块，每个处理重复3次。
取继代培养28~35 d的‘王林’苹果试管苗的叶柄，切成大小均匀的片段，接种于再生培养上，每个培养瓶中接种10个，每个重复2次。
1.2.3 TDZ、6BA和NAA激素组合 分化培养基的基本培养基为MS培养基，附加蔗糖30.0 g/L、琼脂6.0 g/L，分别添加不同浓度的激素组合。在6BA与NAA的组合中，6BA浓度设3种水平(2.0 mg/L、4.0 mg/L、6.0 mg/L)，在每一种6BA浓度组合中，NAA浓度设6个水平(0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.7 mg/L、0.8 mg/L)，共计18个组合；在TDZ和NAA组合处理中，TDZ浓度设3种水平（1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L），每个TDZ浓度下，NAA设同上述的6个水平(TDZ浓度为5.0 mg/L 时，NAA浓度只设0.1 mg/L、0.4 mg/L、0.7 mg/L)，共15个组合。培养基在121 ℃下灭菌20 min。接种结束后进行20 d的暗培养，然后移置于培养架上进行光照培养。接种40 d和50 d后进行叶片和叶柄不定芽再生频率的统计。
1.2.4 再生苗的生根 取生长健壮的再生苗2~3 cm的带芽茎段接种在生根培养基中，进行14 d暗培养后放置于光照条件为16 h/d，温度为2325 ℃，光照强度为20003000 lx培养架上进行光照培养，诱导其生根。
1.3 数据统计方法
外植体接种分别在40 d和50 d后对再生效率进行调查。按下列公式计算不定芽再生频率和平均外植体再生芽数：
不定芽再生频率(%)=再生不定芽的外植体数/接种外植体数×100%
平均每个外植体再生芽数=再生芽总数/再生芽的外植体总数
生根率(%)=生根株数/调查株数×100%
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