水稻抗咪唑啉酮类除草剂基因功能标记的开发和应用
目 录
1 引言 1
2 材料与方法 2
2.1 供试材料 2
2.2 仪器与药品 3
2.3 试验基本原理 3
2.4 引物的设计和合成 3
2.5 DNA提取、PCR扩增和电泳检测 4
3 结果与分析 5
3.1 亲本DNA的提取质量 5
3.2 不同水稻品种（或品系）ALS基因型的检测 6
3.3 南粳0051/抗除草剂黄华占F2群体ALS基因型的检测 7
4 讨 论 7
结 论 11
致 谢 12
参 考 文 献 13
1 引言
水稻，是我国乃至世界上的主要粮食作物。在我国，它的栽培总面积、总产量和单位面积产量一直都遥遥领先于各类粮食作物。杂草危害严重影响着水稻的产量和稻谷品质，每年因为杂草危害造成稻谷减产75亿 kg，损失非常大，特别是这几年随着迅速推广的轻型种植制度，更加重了杂草的危害程度[]。但是，预防和铲除稻田杂草的同时也严重污染了环境，因为在防除杂草的时候人们大都会选择喷洒大量除草剂，这也就导致了投入大量的人力、物力和财力也没有达到预期的防治效果。将抗除草剂基因导入优良水稻品种使其产生对除草剂的抗性，对田间杂草的控制有很大的帮助[]，从而推动我国粮食生产。目前应用比较广泛的一类除草剂是咪唑啉酮类除草剂，受到广大农户的热烈喜爱，因为它具有杀草谱广、用量低、除草效率高等优点[]。
所有的除草剂造成杂草死亡，都是通过干扰与抑制植物生长发育过程中的代谢作用来实现的，其中包括光合作用、细胞分裂、氨基酸、蛋白质及脂肪酸合成、叶绿素、激素及色素合成等，这些代谢过程都是由不同的酶系统诱导，通过抑制靶 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
酶，最后干扰植物的代谢作用而发生除草效应[7]。研究表明，乙酰羟基酸合酶(acetohydroxyacid synthase， AHAS)，也叫乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase， ALS)是咪唑啉酮类除草剂的靶酶；该除草剂阻断底物进入酶活性位点的通路是通过与 ALS 形成复合物来进行的，从而抑制 ALS 活性，阻碍支链氨基酸合成，使植物组织失绿、黄化，最后逐渐死亡[]。ALS 的责任是要催化2个平行反应，一是催化两分子丙酮酸缩合形成 2-乙酰乳酸放出 CO2，最终生成缬氨酸和亮氨酸；二是催化一分子丙酮酸和一分子2-氧丁酸缩合形成乙酰羟基丁酸，最终生成异亮氨酸[]。通过对拟南芥、烟草、水稻、小麦、向日葵、大麦等抗性植物的分子机制的研究，结果表明，抗性植物是由于体内 ALS基因核酸序列产生若干突变的碱基位点，导致所编码的蛋白质的氨基酸残基位点发生改变，从而引起除草剂与 ALS结合方式的变化[-][][]]]]。
限制 SNP 分型的检测精度的因素有很多，例如容易扩增出非特异性片段的四引物 ARMS-PCR 自身；在设计内引物时引入的 3’端错配碱基会降低特异性片段的扩增效率；同时四引物 PCR过程中的内扩增抑制作用的发生是由于外引物对内引物产生的。因此，对扩增条件进行优化很有必要。冷启动酶比较容易导致非特异性扩增，热启动酶能够使PCR 的特异性得到提高。酶浓度低会引起特异片段的扩增量减少；酶浓度高容易导致非特异性扩增增多。颜志强提出错配 PCR 所需的 Taq 酶量和引物浓度与正常 PCR相比要低很多，在目前现有的研究中，Taq酶的用量范围大概在0.4～1.3U /20 μl，很多研究中酶的使用量与常规 PCR 中使用的酶量相当，这可能与引物本身的特异性和扩增效率有关[,16]。内外引物的浓度比例是反应体系优化的重要内容。Ye 等认为内外引物浓度比为10:1 时检测的灵敏度高[]。张建勇、管峰和张羽等发现内外引物浓度比为4:1 时检测灵敏度高[10,-]。而卜莹、胡培丽等则发现内外引物浓度分别为0.6 和0.4μmol /L时的检测效果比较好[-18]。因此，不同的引物，它们的内外引物浓度比也都不相同。但是总体来说，为了增加特异性扩增片段的扩增量，使检测的灵敏度得到提高，仍然可以通过适当的增加内引物的浓度比例来实现。影响 PCR 反应特异性的重要因素之一是退火温度，高退火温度有利于扩增的特异性的提高，但是特异性扩增的产量会降低，可以根据引物的Tm值来设定上下5℃设定温度梯度，从而对退火温度进行优化[12,-]。dNTP 浓度和Mg2 +浓度也会对 Tetraprimer ARMS-PCR 检测的灵敏度产生一定的影响，可以通过设定浓度梯度对它们二者进行优化[10,12,15,17]，现有研究中二者的适宜浓度范围分别为1.5～2 mmol /L和0.1～0.2 mmol /L。
培育抗性品种的关键是找到抗性种质以及对组合后代的准确筛查。但是，鉴定抗粗缩病的常规方法周期长而且容易受到环境条件的影响，陈涛，周丽慧等成功利用四引物设计原理设计出多个优良的鉴定引物。本实验采用四引物设计原理，对测序所获得的突变位点进行四引物设计，并且通过该特定的引物对不同品种（或品系）及组合后代的F1的DNA序列进行PCR扩增，然后对扩增得到的产物的多态性进行分析，从而来判断不同材料的抗性。PCR克服了常规抗病性 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
鉴定的缺点，产生的信息准确性高，可以快速筛选出携带抗性基因的优良种质，为抗除草剂新品种的选育提供优良的种质资源。
2 材料与方法
2.1 供试材料
五个水稻品种（或品系）包括抗除草剂的黄华占、野生型黄华占、宁4204、南粳0051、淮稻5号，三个F1群体宁4204/抗除草剂黄华占、南粳0051/抗除草剂黄华占、淮稻5号/抗除草剂黄华占。分离群体是由抗除草剂黄华占为父本，南粳0051为母本进行杂交、自交获得的162个F2单株组成。所有的供试材料均于2015年春季播种在江苏省农业科学院的试验田内（南京，32°02’N，118°52’E，elev.10m），在5月15日播种，6月20日移栽。按照随机区组设计种植，一共种植2个区组。每个区组包括162个株系和2个亲本。每个小区3行，每行10株，株行距为16.6×26.6cm，所有水稻严格按照水稻常规栽培方式进行管理。为了避免边际效应，成熟后每个小区取中间5株为样本，每株采取2片叶片，并用马克笔标上序号，按顺序放入塑料袋内，再放入4℃冰箱备用。
在植株苗期采取各品种（或品系）及F1、F2的叶片进行基因组DNA的提取，并且分别用设计的四引物进行PCR扩增，然后对扩增产物进行带型分析，最后结合药效实验来鉴定引物的筛选效果。
2.2 仪器与药品
Taq DNA酶、10XPCR Buffer、dNTPs、Mg2+均来自南京鼎思生物有限公司，引物由南京乐进生物工程技术有限公司合成，Life Pro基因扩增仪来自杭州博日科技有限公司。
2.3 试验基本原理
四引物ARMS-PCR的基本原理就是根据目的基因存在的单核苷酸差异来设计等位基因特异引物[]。特异引物仅在一种基因型中有扩增产物，而在另一种基因型中没有扩增产物，所以，通过两次PCR扩增就能够区分出三种基因型。在这个基础上结合四引物的方法，即1对外引物扩增片段包含突变位点，1对反向内引物的3′末端分别对应正常和突变的单核苷酸位点，4条引物链组成的3对引物在一个PCR反应中扩增，通过不同长度和数目的条带，来直观反映出目的基因的等位性变异[]。我们区分突变型与野生型，是能够通过 PCR 方法和电泳图谱直接的得到的，因为在实验的时候我们可以针对不同的已知突变，设计与之相合适的引物。在突变点的两侧分别设计一对外引物和一对特异性内引物：突变是否发生可以用特异性内引物来检测；外引物在 PCR 反应中不但能作为阳性参照，而且能和特异性内引物分别配对，有选择性地扩增突变型与野生型个体基因，这样既可以节约费用，又可以简化后来的优化过程[]。
1 引言 1
2 材料与方法 2
2.1 供试材料 2
2.2 仪器与药品 3
2.3 试验基本原理 3
2.4 引物的设计和合成 3
2.5 DNA提取、PCR扩增和电泳检测 4
3 结果与分析 5
3.1 亲本DNA的提取质量 5
3.2 不同水稻品种（或品系）ALS基因型的检测 6
3.3 南粳0051/抗除草剂黄华占F2群体ALS基因型的检测 7
4 讨 论 7
结 论 11
致 谢 12
参 考 文 献 13
1 引言
水稻，是我国乃至世界上的主要粮食作物。在我国，它的栽培总面积、总产量和单位面积产量一直都遥遥领先于各类粮食作物。杂草危害严重影响着水稻的产量和稻谷品质，每年因为杂草危害造成稻谷减产75亿 kg，损失非常大，特别是这几年随着迅速推广的轻型种植制度，更加重了杂草的危害程度[]。但是，预防和铲除稻田杂草的同时也严重污染了环境，因为在防除杂草的时候人们大都会选择喷洒大量除草剂，这也就导致了投入大量的人力、物力和财力也没有达到预期的防治效果。将抗除草剂基因导入优良水稻品种使其产生对除草剂的抗性，对田间杂草的控制有很大的帮助[]，从而推动我国粮食生产。目前应用比较广泛的一类除草剂是咪唑啉酮类除草剂，受到广大农户的热烈喜爱，因为它具有杀草谱广、用量低、除草效率高等优点[]。
所有的除草剂造成杂草死亡，都是通过干扰与抑制植物生长发育过程中的代谢作用来实现的，其中包括光合作用、细胞分裂、氨基酸、蛋白质及脂肪酸合成、叶绿素、激素及色素合成等，这些代谢过程都是由不同的酶系统诱导，通过抑制靶 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
酶，最后干扰植物的代谢作用而发生除草效应[7]。研究表明，乙酰羟基酸合酶(acetohydroxyacid synthase， AHAS)，也叫乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase， ALS)是咪唑啉酮类除草剂的靶酶；该除草剂阻断底物进入酶活性位点的通路是通过与 ALS 形成复合物来进行的，从而抑制 ALS 活性，阻碍支链氨基酸合成，使植物组织失绿、黄化，最后逐渐死亡[]。ALS 的责任是要催化2个平行反应，一是催化两分子丙酮酸缩合形成 2-乙酰乳酸放出 CO2，最终生成缬氨酸和亮氨酸；二是催化一分子丙酮酸和一分子2-氧丁酸缩合形成乙酰羟基丁酸，最终生成异亮氨酸[]。通过对拟南芥、烟草、水稻、小麦、向日葵、大麦等抗性植物的分子机制的研究，结果表明，抗性植物是由于体内 ALS基因核酸序列产生若干突变的碱基位点，导致所编码的蛋白质的氨基酸残基位点发生改变，从而引起除草剂与 ALS结合方式的变化[-][][]]]]。
限制 SNP 分型的检测精度的因素有很多，例如容易扩增出非特异性片段的四引物 ARMS-PCR 自身；在设计内引物时引入的 3’端错配碱基会降低特异性片段的扩增效率；同时四引物 PCR过程中的内扩增抑制作用的发生是由于外引物对内引物产生的。因此，对扩增条件进行优化很有必要。冷启动酶比较容易导致非特异性扩增，热启动酶能够使PCR 的特异性得到提高。酶浓度低会引起特异片段的扩增量减少；酶浓度高容易导致非特异性扩增增多。颜志强提出错配 PCR 所需的 Taq 酶量和引物浓度与正常 PCR相比要低很多，在目前现有的研究中，Taq酶的用量范围大概在0.4～1.3U /20 μl，很多研究中酶的使用量与常规 PCR 中使用的酶量相当，这可能与引物本身的特异性和扩增效率有关[,16]。内外引物的浓度比例是反应体系优化的重要内容。Ye 等认为内外引物浓度比为10:1 时检测的灵敏度高[]。张建勇、管峰和张羽等发现内外引物浓度比为4:1 时检测灵敏度高[10,-]。而卜莹、胡培丽等则发现内外引物浓度分别为0.6 和0.4μmol /L时的检测效果比较好[-18]。因此，不同的引物，它们的内外引物浓度比也都不相同。但是总体来说，为了增加特异性扩增片段的扩增量，使检测的灵敏度得到提高，仍然可以通过适当的增加内引物的浓度比例来实现。影响 PCR 反应特异性的重要因素之一是退火温度，高退火温度有利于扩增的特异性的提高，但是特异性扩增的产量会降低，可以根据引物的Tm值来设定上下5℃设定温度梯度，从而对退火温度进行优化[12,-]。dNTP 浓度和Mg2 +浓度也会对 Tetraprimer ARMS-PCR 检测的灵敏度产生一定的影响，可以通过设定浓度梯度对它们二者进行优化[10,12,15,17]，现有研究中二者的适宜浓度范围分别为1.5～2 mmol /L和0.1～0.2 mmol /L。
培育抗性品种的关键是找到抗性种质以及对组合后代的准确筛查。但是，鉴定抗粗缩病的常规方法周期长而且容易受到环境条件的影响，陈涛，周丽慧等成功利用四引物设计原理设计出多个优良的鉴定引物。本实验采用四引物设计原理，对测序所获得的突变位点进行四引物设计，并且通过该特定的引物对不同品种（或品系）及组合后代的F1的DNA序列进行PCR扩增，然后对扩增得到的产物的多态性进行分析，从而来判断不同材料的抗性。PCR克服了常规抗病性 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
鉴定的缺点，产生的信息准确性高，可以快速筛选出携带抗性基因的优良种质，为抗除草剂新品种的选育提供优良的种质资源。
2 材料与方法
2.1 供试材料
五个水稻品种（或品系）包括抗除草剂的黄华占、野生型黄华占、宁4204、南粳0051、淮稻5号，三个F1群体宁4204/抗除草剂黄华占、南粳0051/抗除草剂黄华占、淮稻5号/抗除草剂黄华占。分离群体是由抗除草剂黄华占为父本，南粳0051为母本进行杂交、自交获得的162个F2单株组成。所有的供试材料均于2015年春季播种在江苏省农业科学院的试验田内（南京，32°02’N，118°52’E，elev.10m），在5月15日播种，6月20日移栽。按照随机区组设计种植，一共种植2个区组。每个区组包括162个株系和2个亲本。每个小区3行，每行10株，株行距为16.6×26.6cm，所有水稻严格按照水稻常规栽培方式进行管理。为了避免边际效应，成熟后每个小区取中间5株为样本，每株采取2片叶片，并用马克笔标上序号，按顺序放入塑料袋内，再放入4℃冰箱备用。
在植株苗期采取各品种（或品系）及F1、F2的叶片进行基因组DNA的提取，并且分别用设计的四引物进行PCR扩增，然后对扩增产物进行带型分析，最后结合药效实验来鉴定引物的筛选效果。
2.2 仪器与药品
Taq DNA酶、10XPCR Buffer、dNTPs、Mg2+均来自南京鼎思生物有限公司，引物由南京乐进生物工程技术有限公司合成，Life Pro基因扩增仪来自杭州博日科技有限公司。
2.3 试验基本原理
四引物ARMS-PCR的基本原理就是根据目的基因存在的单核苷酸差异来设计等位基因特异引物[]。特异引物仅在一种基因型中有扩增产物，而在另一种基因型中没有扩增产物，所以，通过两次PCR扩增就能够区分出三种基因型。在这个基础上结合四引物的方法，即1对外引物扩增片段包含突变位点，1对反向内引物的3′末端分别对应正常和突变的单核苷酸位点，4条引物链组成的3对引物在一个PCR反应中扩增，通过不同长度和数目的条带，来直观反映出目的基因的等位性变异[]。我们区分突变型与野生型，是能够通过 PCR 方法和电泳图谱直接的得到的，因为在实验的时候我们可以针对不同的已知突变，设计与之相合适的引物。在突变点的两侧分别设计一对外引物和一对特异性内引物：突变是否发生可以用特异性内引物来检测；外引物在 PCR 反应中不但能作为阳性参照，而且能和特异性内引物分别配对，有选择性地扩增突变型与野生型个体基因，这样既可以节约费用，又可以简化后来的优化过程[]。
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