梨种子败育相关基因的克隆及表达特性研究
摘要：为了探明梨种子败育基因的序列特征和表达特点，以‘鸭梨’和败育梨（‘鸭梨’ב巴梨’）为试材，对Pbr010558.1基因进行克隆和序列分析，并研究其在不同发育时期的基因表达。结果表明，Pbr010558.1基因cDNA全长为1275bp，编码的多肽由425个氨基酸组成。与‘砀山酥梨’基因组比对发现核苷酸同源性达92.06%，和拟南芥At4g24900基因比对发现核苷酸同源性达59.72%，在氨基酸水平上，Pbr010558.1与At4g24900的序列相似性为42%。实时荧光定量PCR分析表明，Pbr010558.1基因在败育梨和‘鸭梨’胚胎发育过程中表达量大且变化明显，果实发育前期，‘鸭梨’和败育梨中Pbr010558.1基因的表达量都是先增加后降低，并在第17天达到最高，在花后22天以后，Pbr010558.1基因在败育梨中的表达量依然很高，在鸭梨中的表达量却迅速降低。败育梨与‘鸭梨’中Pbr010558.1基因表达的差异表明，该基因可能是控制败育梨种子败育的关键基因。本研究为进一步研究梨种子败育机制提供基础资料。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1.材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1 植物材料 2
1.1.2试剂2
1.2方法2
1.2.1梨果实总RNA的提取及纯化2
1.2.2 Pbr010558.1基因cDNA的全长克隆3
1.2.3基因定量表达分析 5
2.结果与分析5
2.1败育梨果实Pbr010558.1基因全长的克隆5
2.2基因序列分析与序列相似性比较5
2.3 败育相关基因Pbr010558.1的表达特性分析 8
3.讨论8
致谢10
参考文献11
表1 反转录体系3
表2 PCR反应体系 3
表3 连接反应体系4
图1败育梨Pbr010558.1基因PCR扩增5
图2 Pbr010558.1与At4g24900核苷酸序列比对 6
/> 图3 Pbr010558.1与At4g24900氨基酸序列比对 7
图4 败育梨与‘砀山酥梨’的Pbr010558.1核苷酸序列比对 8
图5 败育梨和‘鸭梨’的Pbr010558.1基因在不同发育时期的表达 8
梨种子败育相关基因的克隆和表达特性研究
引言
梨(Pyrus)是蔷薇科梨属植物，是我国仅次于苹果、柑橘的第三大水果，在我国栽培范围广，栽培历史悠久，规模优势明显，是颇具特色的重要经济作物[1]；梨果肉质脆嫩、汁多味甜，含有多种营养成分，深受消费者的喜爱。
果实发育与种子质量密切相关，原因在于种子是产生多种激素的中心，它能产生一个生理上强有力的“库”，有利于幼果对养分的竞争，从而保证果实的正常发育。种子与人类的生产和生活紧密相关。在作物中，人们主要以种子作为粮食来源，许多植物的种子可做药用，还有一些是工业材料的来源，因而提高植物的种子产量和质量具有重要的实际意义[2]。种子是多数植物得以繁衍的起始材料，对影响胚胎和胚乳发育中基因功能的研究不仅对真核生物生活史具有重要的理论价值，也在提高粮食产量、开发功能食品和定向改良作物等诸多领域有重要的应用前景。
植物胚是一个具有全能性的多细胞结构,其来源有两种:有性的合子胚,无性的体细胞胚或不定胚。胚在适宜条件下能完全发育成熟, 播种后可直接长成完整植株。但是,果树上一些常用的育种方法如远缘杂交、二倍体(母本)与四倍体(父本)杂交、以早熟品种作杂交母本及柑桔育种中, 获得的合子胚常常在发育早期就出现败育或退化,仅留下部分硬化的种痕[3]。
胚败育现象普遍存在于大田作物[46]和园艺作物[79]中 , 在果树远缘杂交 、不同倍性亲本之间杂交及无核品种的选育中胚败育尤为严重。造成这种败育的原因可能有多种，但从目前有关的研究成果看，这些原因大致可归纳为七类：胚囊发育异常、胚乳发育异常、幼胚起源、营养供应失调、内源激素、酚类物质、某些酶活及基因调控等方面[10]。
在拟南芥[11]、葡萄[12]、荔枝[13]枣、枇杷等一些物种上，种子败育问题的研究已取得较大进展，针对败育机理采取相应的防治措施也取得了很大的成就，但在蔷薇科植物上的研究很少。目前对种子败育的各项研究，仍存在一些问题，主要表现在：种子败育机理研究与生产上防治败育的措施结合不紧密；种子败育的调控措施不完善；关于种子败育的分子机制的研究还比较少[14]。
多年来，科学家们对影响植物胚胎发生的基因展开了广泛的研究，其中的一些基因与胚胎早期形态建成相关。在鉴定这些基因的过程中发现了至少250个胚缺陷基因为胚正常发育所不可或缺[15]。各国学者通过对模式植物拟南芥和其它植物胚胎发育过程中的胚胎突变体基因表达调控的研究，已分离克隆出 AGLI1、KN1、SIN等多个与植物胚胎发育相关的基因[16]。
本实验选用‘巴梨’与‘鸭梨’的杂交后代败育梨和其中一个亲本‘鸭梨’作为实验材料，以模式植物拟南芥中与种子败育相关的基因At4g24900为原始序列，在‘砀山酥梨’基因库中进行比对，挑选出相似度高（Identities≥50%,Positives≥70%）的基因Pbr010558.1，克隆该基因，进行序列分析，并对该基因进行半定量检测及荧光定量PCR观察表达量，进一步为分子定向育种提供基因资源。
材料与方法
1.1材料
1.1.1 植物材料
试材为河北省昌黎县果树研究所采取的‘鸭梨’和败育梨（‘鸭梨’ב巴梨’）。
1.1.2 试剂
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α由大学梨工程技术研究中心保存；Rever Tre Ace TM Kit购自 TOYOBO 公司；DNaseⅠ、 LA Taq DNA 聚合酶、pMD19 T 载体、dNTPs、SYBR染料和 DNA marker 均购自 TaKaRa 公司；凝胶回收试剂盒购自 Axygen 公司。PCR引物的合成和测序均由上海英骏生物技术有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 梨果实总RNA的提取及纯化
采用改良的CTAB法[17]提取梨果核总RNA，具体操作过程如下：吸取4mLCTAB提取液于10mL离心管中，置于65℃水浴锅中预热备用。取超低温冰箱中保存的梨果核约2g，放入液氮处理过的研钵，边研磨边不断加入液氮直至粉末状，保持样品干燥，将粉末迅速加入到自备的已经65℃水浴中加热1min。加入4mL氯仿混匀，平衡后在15℃下10000r/min离心10min，取上清液于另一新的10mL离心管中。重复上一步操作步骤。加入1/4体积的12mol/L LiCl溶液，轻轻摇匀，4℃冰箱放置过夜。上述溶液在4℃下10000r/min离心20min。小心的倒掉吸干上清液，倒扣在面纸上静置一会，待溶液被吸干。用200μL经65℃预热的SSTE溶液溶解沉淀，并转移到干净的1.5mL的离心管中。加入4mL氯仿混匀，平衡后在15℃下10000r/min离心5min，取上清液于另一新的1.5mL离心管中。加入2倍体积的无水乙醇，轻轻摇匀，于20℃放置2h。在4℃、10000r/min离心20min。吸干上清液，将离心管敞开静置一会，待RNA干燥，20μLDEPC水溶解，80℃保存备用。
DNase消化基因组DNA，对总RNA进行纯化：取10μL总RNA溶液，加入10×DNase I buffer 5μL，RNase inhibitor 0.5μL，DAase I 2μL，DEPC处理H2O 32.5μL,37℃水浴保温30min。加DEPC处理H2O 50μL，苯酚/氯仿/已戊醇（25：24：1）溶液并充分混匀100μL。离心取上清，移入另一离心管，加入10μL（1/10量）3NaAC(pH5.2)。加入250μL（2.5倍）预冷无水乙醇，20℃静置60min。离心回收，70%冷乙醇洗涤沉淀，真空干燥后用DEPC处理H2O溶解。琼脂糖胶检测。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1.材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1 植物材料 2
1.1.2试剂2
1.2方法2
1.2.1梨果实总RNA的提取及纯化2
1.2.2 Pbr010558.1基因cDNA的全长克隆3
1.2.3基因定量表达分析 5
2.结果与分析5
2.1败育梨果实Pbr010558.1基因全长的克隆5
2.2基因序列分析与序列相似性比较5
2.3 败育相关基因Pbr010558.1的表达特性分析 8
3.讨论8
致谢10
参考文献11
表1 反转录体系3
表2 PCR反应体系 3
表3 连接反应体系4
图1败育梨Pbr010558.1基因PCR扩增5
图2 Pbr010558.1与At4g24900核苷酸序列比对 6
/> 图3 Pbr010558.1与At4g24900氨基酸序列比对 7
图4 败育梨与‘砀山酥梨’的Pbr010558.1核苷酸序列比对 8
图5 败育梨和‘鸭梨’的Pbr010558.1基因在不同发育时期的表达 8
梨种子败育相关基因的克隆和表达特性研究
引言
梨(Pyrus)是蔷薇科梨属植物，是我国仅次于苹果、柑橘的第三大水果，在我国栽培范围广，栽培历史悠久，规模优势明显，是颇具特色的重要经济作物[1]；梨果肉质脆嫩、汁多味甜，含有多种营养成分，深受消费者的喜爱。
果实发育与种子质量密切相关，原因在于种子是产生多种激素的中心，它能产生一个生理上强有力的“库”，有利于幼果对养分的竞争，从而保证果实的正常发育。种子与人类的生产和生活紧密相关。在作物中，人们主要以种子作为粮食来源，许多植物的种子可做药用，还有一些是工业材料的来源，因而提高植物的种子产量和质量具有重要的实际意义[2]。种子是多数植物得以繁衍的起始材料，对影响胚胎和胚乳发育中基因功能的研究不仅对真核生物生活史具有重要的理论价值，也在提高粮食产量、开发功能食品和定向改良作物等诸多领域有重要的应用前景。
植物胚是一个具有全能性的多细胞结构,其来源有两种:有性的合子胚,无性的体细胞胚或不定胚。胚在适宜条件下能完全发育成熟, 播种后可直接长成完整植株。但是,果树上一些常用的育种方法如远缘杂交、二倍体(母本)与四倍体(父本)杂交、以早熟品种作杂交母本及柑桔育种中, 获得的合子胚常常在发育早期就出现败育或退化,仅留下部分硬化的种痕[3]。
胚败育现象普遍存在于大田作物[46]和园艺作物[79]中 , 在果树远缘杂交 、不同倍性亲本之间杂交及无核品种的选育中胚败育尤为严重。造成这种败育的原因可能有多种，但从目前有关的研究成果看，这些原因大致可归纳为七类：胚囊发育异常、胚乳发育异常、幼胚起源、营养供应失调、内源激素、酚类物质、某些酶活及基因调控等方面[10]。
在拟南芥[11]、葡萄[12]、荔枝[13]枣、枇杷等一些物种上，种子败育问题的研究已取得较大进展，针对败育机理采取相应的防治措施也取得了很大的成就，但在蔷薇科植物上的研究很少。目前对种子败育的各项研究，仍存在一些问题，主要表现在：种子败育机理研究与生产上防治败育的措施结合不紧密；种子败育的调控措施不完善；关于种子败育的分子机制的研究还比较少[14]。
多年来，科学家们对影响植物胚胎发生的基因展开了广泛的研究，其中的一些基因与胚胎早期形态建成相关。在鉴定这些基因的过程中发现了至少250个胚缺陷基因为胚正常发育所不可或缺[15]。各国学者通过对模式植物拟南芥和其它植物胚胎发育过程中的胚胎突变体基因表达调控的研究，已分离克隆出 AGLI1、KN1、SIN等多个与植物胚胎发育相关的基因[16]。
本实验选用‘巴梨’与‘鸭梨’的杂交后代败育梨和其中一个亲本‘鸭梨’作为实验材料，以模式植物拟南芥中与种子败育相关的基因At4g24900为原始序列，在‘砀山酥梨’基因库中进行比对，挑选出相似度高（Identities≥50%,Positives≥70%）的基因Pbr010558.1，克隆该基因，进行序列分析，并对该基因进行半定量检测及荧光定量PCR观察表达量，进一步为分子定向育种提供基因资源。
材料与方法
1.1材料
1.1.1 植物材料
试材为河北省昌黎县果树研究所采取的‘鸭梨’和败育梨（‘鸭梨’ב巴梨’）。
1.1.2 试剂
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α由大学梨工程技术研究中心保存；Rever Tre Ace TM Kit购自 TOYOBO 公司；DNaseⅠ、 LA Taq DNA 聚合酶、pMD19 T 载体、dNTPs、SYBR染料和 DNA marker 均购自 TaKaRa 公司；凝胶回收试剂盒购自 Axygen 公司。PCR引物的合成和测序均由上海英骏生物技术有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 梨果实总RNA的提取及纯化
采用改良的CTAB法[17]提取梨果核总RNA，具体操作过程如下：吸取4mLCTAB提取液于10mL离心管中，置于65℃水浴锅中预热备用。取超低温冰箱中保存的梨果核约2g，放入液氮处理过的研钵，边研磨边不断加入液氮直至粉末状，保持样品干燥，将粉末迅速加入到自备的已经65℃水浴中加热1min。加入4mL氯仿混匀，平衡后在15℃下10000r/min离心10min，取上清液于另一新的10mL离心管中。重复上一步操作步骤。加入1/4体积的12mol/L LiCl溶液，轻轻摇匀，4℃冰箱放置过夜。上述溶液在4℃下10000r/min离心20min。小心的倒掉吸干上清液，倒扣在面纸上静置一会，待溶液被吸干。用200μL经65℃预热的SSTE溶液溶解沉淀，并转移到干净的1.5mL的离心管中。加入4mL氯仿混匀，平衡后在15℃下10000r/min离心5min，取上清液于另一新的1.5mL离心管中。加入2倍体积的无水乙醇，轻轻摇匀，于20℃放置2h。在4℃、10000r/min离心20min。吸干上清液，将离心管敞开静置一会，待RNA干燥，20μLDEPC水溶解，80℃保存备用。
DNase消化基因组DNA，对总RNA进行纯化：取10μL总RNA溶液，加入10×DNase I buffer 5μL，RNase inhibitor 0.5μL，DAase I 2μL，DEPC处理H2O 32.5μL,37℃水浴保温30min。加DEPC处理H2O 50μL，苯酚/氯仿/已戊醇（25：24：1）溶液并充分混匀100μL。离心取上清，移入另一离心管，加入10μL（1/10量）3NaAC(pH5.2)。加入250μL（2.5倍）预冷无水乙醇，20℃静置60min。离心回收，70%冷乙醇洗涤沉淀，真空干燥后用DEPC处理H2O溶解。琼脂糖胶检测。
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