与水稻直链淀粉含量相关基因du1的crisprcas9敲除载体的构建(附件)
本课题从NCBI官网收索并获得Du1基因野生型和突变体序列，并进行初步的分析。基于CRISPR/Cas9对NGG特异序列识别特点，设计针对Du1基因的上下游靶序列。酶切连接，构建和扩增gRNA表达盒，将扩增产物边酶切边连的方式连接CRISPR/Cas9植物双元表达载体，通过转化大肠杆菌DH5α、质粒酶切检测与测序结果的分析，表明水稻Du1基因的CRISPR基因敲除载体构建成功。这为之后的水稻的遗传转化打下了良好的基础。关键词 水稻，Du1，直链淀粉含量相关基因，CRISPR/Cas9
目 录
1 引言1
1.1 水稻直链淀粉遗传基因Du1的研究现状1
1.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术的研究现状2
1.2.1 CRISPR/Cas9技术的基本原理3
1.2.2 CRISPR/Cas9技术在基因组编辑中的应用4
1.3 本课题研究的目的与意义4
2 实验材料与方法5
2.1 实验材料5
2.1.1 水稻材料5
2.1.2 质粒载体与菌株种类5
2.1.3 试剂材料5
2.1.4 引物设计6
2.1.5 引物合成及测序7
2.2 实验方法7
2.2.1 Du1基因的生物信息学查询与分析7
2.2.2 CRISPR靶位点选择及验证 7
2.2.3 Du1基因的CRISPR/Cas9表达载体的构建和检测7 3 结果与分析12
3.1 水稻Du1生物信息学分析12
3.2 水稻直链淀粉基因Du1的CRISPR/Cas9表达载体的构建及检测14
3.2.1 CRISPR/Cas9表达载体的构建 14
3.2.2 转化大肠杆菌及菌液Pcr验证15
3.2.3 载体测序结果分析15
结论18
致谢19参考文献 20 1 引言
近年来，随着多种异性核酸酶都取得了突破性的进展，CRISPR/Cas9基因编辑技术也由于其一些潜在的应用价 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
值成为了各个领域的关注热点。针对某个基因，CRISPR/Cas9仅需要构建一个sgRNA并且基因组出现GG就可以了。其通过靶DNA 序列与RNA 介导核酸酶结合的具有一定的特殊性和灵活性[1]，作为第三代人工核酸酶CRISPR/Cas9突破了模式的限制[1]。
随着人们经济水平的日益突破和生活质量的不断提升，大多数人对优质稻米的要求也越来越严格。而直链淀粉含量是水稻淀粉的一个重要参数，其水稻直链淀粉含量的高低直接影响着水稻淀粉的特性和用途。其中与稻米直链淀粉含量相关的基因分别有有Wx基因和Du基因，直链淀粉含量除了一方面受Wx基因的控制外，另一方面还受Du基因的影响，据部分研究表明，目前已发现分别定位于第4、6、7、9染色体上的至少7个不同的Du基因，其中通过影响Wxb基因的preRNA的有效剪接来降低稻米直链淀粉含量很有可能是Du1、Du2基因。
1.1 水稻直链淀粉遗传基因Du1的研究现状
迄今为止，可以说水稻在中国粮食中占着举足轻重的地位。显而易见的是淀粉是影响稻米品质的主要成分之一，支链淀粉和直链淀粉构成了淀粉。前者含量约在5%~15%左右，后者含量在0%~40%左右。通常来说，直链淀粉含量>20%以上的稻米品种口味稍差，直链淀粉在15%~20%以下口味较好[2]。有研究表明，米饭的弹性、硬度、黏性与水稻的直链淀粉含量密切相关，其含量越高，淀粉颗粒就越紧实，饭粒就比较干燥且无色泽、米饭口感差、咀嚼有渣感。反之，米饭硬性小色泽光度好、咀嚼有弹性且无渣感[3]。因此，水稻的直链淀粉含量成了评判其稻米品质的重要指标，且对稻米品质的控制与鉴定、优质稻米的的生产与培育都是必不可少的。并且直链淀粉已经在部分行业起到了很重要的作用[4]。直链淀粉的分子量约为1×10^4～ 2.5×10^5，几乎不分支，或分支的极少[5]。直链淀粉的遗传十分繁杂，胚乳三倍体基因型掌控其遗传，此外还受别的一些母体与环境互作效应及母体核基因的某些影响[6]。由于直链淀粉颗粒稍小且晶体的结构紧密，水分子难以进入，其糊化程度也就越大[7]。
Wx基因又分为等位基因Wx^a和Wx^b，其中籼稻直链淀粉含量较高，主要以Wx^a为主。粳稻则含量较低，以Wx^b为主[8]。目前，许多淀粉生物合成基因的表达水平也受到Du1突变的影响，但是对淀粉生物合成的了解在Du突变体中仍然是非常有限的。当其颗粒干燥时，其具有较低的胚乳AC和中等程度的半透明。生化分析表明Du1突变体中相对低的AC是由Wx蛋白水平降低引起的。
Du1基因在谷物淀粉生物合成的前mRNA的剪接中起作用，明确地影响Wxb的剪接效率并通过介导调节淀粉生物合成基因的表达。要了解Du1植物中淀粉生物合成基因的表达改变是否影响AC以外的其他晶粒性质，有人比较了野生型和Du1颗粒之间的颗粒重量，碱消化率和凝胶稠度。结果表明，Du1突变特异性地影响了Wxb前mRNA的剪接，导致成熟Wxb转录物的积累水平较低，这又导致Du1突变体中AC的显着降低。此外，Du1的克隆和分子表征可以促进水稻的分子遗传工程[25]。利用Du1基因将其导入到较高或高直链淀粉含量的水稻中，可以适当减少这些品种的直链淀粉含量，有可能培育出满足广大消费群体需求的中等直链淀粉含量优质水稻品种。通过Du1基因使直链淀粉含量下降的同时，可以提高支链淀粉中短链比例，从而提高食味品质[9]。
1.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术的研究现状
基因编辑是一项基因工程技术主要是对于基因组进行修饰以及人工改造。CRISPR/Cas9是当前基因编辑组中应用极其广泛的一种新技术，是一种获得性的免疫系统，存在于细菌或古细菌中，经过CRISPR的有关蛋白及其转录产物crRNA，特别是Cas9特异性蛋白抵制进入DNA[10]。和ZFN和TALEN这两种技术相比较，CRISPR / Cas9 系统设计并合成sgRNA愈加容易，且具有精度高、成本低、周期短、系统构建简便、能够靶向性地编辑基因组等一系列的优点[11]。Marraffini 等初次运用实验验证CRISPR系统的作用，由此科学研究者们就拉开了探索CRISPR系统作用机制的帷幕。之后迅速发现CRISPR 系统在医医疗、食品、工业中也存在着潜在应用价值，使其成为研究的热门话题[12]。近年来，通过哈佛和美国的麻省理工的张峰博士鉴定出Cpf1蛋白来源于CRISPR系统，其功能与Cas9蛋白类似。毋庸置疑，此研究是CRISPR基因编辑技术的一个重要里程碑[13]。
目 录
1 引言1
1.1 水稻直链淀粉遗传基因Du1的研究现状1
1.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术的研究现状2
1.2.1 CRISPR/Cas9技术的基本原理3
1.2.2 CRISPR/Cas9技术在基因组编辑中的应用4
1.3 本课题研究的目的与意义4
2 实验材料与方法5
2.1 实验材料5
2.1.1 水稻材料5
2.1.2 质粒载体与菌株种类5
2.1.3 试剂材料5
2.1.4 引物设计6
2.1.5 引物合成及测序7
2.2 实验方法7
2.2.1 Du1基因的生物信息学查询与分析7
2.2.2 CRISPR靶位点选择及验证 7
2.2.3 Du1基因的CRISPR/Cas9表达载体的构建和检测7 3 结果与分析12
3.1 水稻Du1生物信息学分析12
3.2 水稻直链淀粉基因Du1的CRISPR/Cas9表达载体的构建及检测14
3.2.1 CRISPR/Cas9表达载体的构建 14
3.2.2 转化大肠杆菌及菌液Pcr验证15
3.2.3 载体测序结果分析15
结论18
致谢19参考文献 20 1 引言
近年来，随着多种异性核酸酶都取得了突破性的进展，CRISPR/Cas9基因编辑技术也由于其一些潜在的应用价 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
值成为了各个领域的关注热点。针对某个基因，CRISPR/Cas9仅需要构建一个sgRNA并且基因组出现GG就可以了。其通过靶DNA 序列与RNA 介导核酸酶结合的具有一定的特殊性和灵活性[1]，作为第三代人工核酸酶CRISPR/Cas9突破了模式的限制[1]。
随着人们经济水平的日益突破和生活质量的不断提升，大多数人对优质稻米的要求也越来越严格。而直链淀粉含量是水稻淀粉的一个重要参数，其水稻直链淀粉含量的高低直接影响着水稻淀粉的特性和用途。其中与稻米直链淀粉含量相关的基因分别有有Wx基因和Du基因，直链淀粉含量除了一方面受Wx基因的控制外，另一方面还受Du基因的影响，据部分研究表明，目前已发现分别定位于第4、6、7、9染色体上的至少7个不同的Du基因，其中通过影响Wxb基因的preRNA的有效剪接来降低稻米直链淀粉含量很有可能是Du1、Du2基因。
1.1 水稻直链淀粉遗传基因Du1的研究现状
迄今为止，可以说水稻在中国粮食中占着举足轻重的地位。显而易见的是淀粉是影响稻米品质的主要成分之一，支链淀粉和直链淀粉构成了淀粉。前者含量约在5%~15%左右，后者含量在0%~40%左右。通常来说，直链淀粉含量>20%以上的稻米品种口味稍差，直链淀粉在15%~20%以下口味较好[2]。有研究表明，米饭的弹性、硬度、黏性与水稻的直链淀粉含量密切相关，其含量越高，淀粉颗粒就越紧实，饭粒就比较干燥且无色泽、米饭口感差、咀嚼有渣感。反之，米饭硬性小色泽光度好、咀嚼有弹性且无渣感[3]。因此，水稻的直链淀粉含量成了评判其稻米品质的重要指标，且对稻米品质的控制与鉴定、优质稻米的的生产与培育都是必不可少的。并且直链淀粉已经在部分行业起到了很重要的作用[4]。直链淀粉的分子量约为1×10^4～ 2.5×10^5，几乎不分支，或分支的极少[5]。直链淀粉的遗传十分繁杂，胚乳三倍体基因型掌控其遗传，此外还受别的一些母体与环境互作效应及母体核基因的某些影响[6]。由于直链淀粉颗粒稍小且晶体的结构紧密，水分子难以进入，其糊化程度也就越大[7]。
Wx基因又分为等位基因Wx^a和Wx^b，其中籼稻直链淀粉含量较高，主要以Wx^a为主。粳稻则含量较低，以Wx^b为主[8]。目前，许多淀粉生物合成基因的表达水平也受到Du1突变的影响，但是对淀粉生物合成的了解在Du突变体中仍然是非常有限的。当其颗粒干燥时，其具有较低的胚乳AC和中等程度的半透明。生化分析表明Du1突变体中相对低的AC是由Wx蛋白水平降低引起的。
Du1基因在谷物淀粉生物合成的前mRNA的剪接中起作用，明确地影响Wxb的剪接效率并通过介导调节淀粉生物合成基因的表达。要了解Du1植物中淀粉生物合成基因的表达改变是否影响AC以外的其他晶粒性质，有人比较了野生型和Du1颗粒之间的颗粒重量，碱消化率和凝胶稠度。结果表明，Du1突变特异性地影响了Wxb前mRNA的剪接，导致成熟Wxb转录物的积累水平较低，这又导致Du1突变体中AC的显着降低。此外，Du1的克隆和分子表征可以促进水稻的分子遗传工程[25]。利用Du1基因将其导入到较高或高直链淀粉含量的水稻中，可以适当减少这些品种的直链淀粉含量，有可能培育出满足广大消费群体需求的中等直链淀粉含量优质水稻品种。通过Du1基因使直链淀粉含量下降的同时，可以提高支链淀粉中短链比例，从而提高食味品质[9]。
1.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术的研究现状
基因编辑是一项基因工程技术主要是对于基因组进行修饰以及人工改造。CRISPR/Cas9是当前基因编辑组中应用极其广泛的一种新技术，是一种获得性的免疫系统，存在于细菌或古细菌中，经过CRISPR的有关蛋白及其转录产物crRNA，特别是Cas9特异性蛋白抵制进入DNA[10]。和ZFN和TALEN这两种技术相比较，CRISPR / Cas9 系统设计并合成sgRNA愈加容易，且具有精度高、成本低、周期短、系统构建简便、能够靶向性地编辑基因组等一系列的优点[11]。Marraffini 等初次运用实验验证CRISPR系统的作用，由此科学研究者们就拉开了探索CRISPR系统作用机制的帷幕。之后迅速发现CRISPR 系统在医医疗、食品、工业中也存在着潜在应用价值，使其成为研究的热门话题[12]。近年来，通过哈佛和美国的麻省理工的张峰博士鉴定出Cpf1蛋白来源于CRISPR系统，其功能与Cas9蛋白类似。毋庸置疑，此研究是CRISPR基因编辑技术的一个重要里程碑[13]。
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