DEHP与四环素互作对土壤呼吸、生物量C以及过氧化氢酶的影响
目录
1 引言 1
2 材料与方法 2
2.1 土壤 2
2.2 主要试剂 2
2.3 主要仪器 3
2.4 实验设计 3
2.5 测定内容 4
3 结果 4
3.1 土壤基础呼吸强度 4
3.2 土壤微生物量C 10
3.3 过氧化氢酶 14
4 讨论 17
结论 19
致谢 20
参考文献 21
1 引言
全球邻苯二甲酸酯类化合物（Phthalic acid esters, PAEs）的污染已经超过了DDT(二氯二苯三氯乙烷) 和BHC(六氯环己烷) ,成为环境科学工作者研究的重要有机污染物之一。邻苯二甲酸二异辛酯(di-(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP)是有毒的化工用塑料软化剂，属无色，无味液体，添加后可让微力分子更均匀散步，从而增加延展性，弹性和柔软度，故在工业用途上，DEHP是塑化剂最主要的一种被普遍应用于橡胶管及塑料薄膜润滑剂、润滑油和去污剂等数百种产品的生产中。美国环保局（EPA ）将6 种邻苯二甲酸酯类化合物列入129种重点控制的污染物名单中,包括邻苯二甲酸二甲酯(DMP) 、邻苯二甲酸二乙酯(DEP) 、邻苯二甲酸二丁酯(DBP) 、邻苯二甲酸二辛酯(DOP) 、邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP) 和邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP) 。这些酞酸酯与塑料分子由氢键或范德华力联接,彼此间保留各自相对独立的化学性质,因此随着使用时间的推移,这些酞酸酯可从塑料中转移到环境中,造成环境的污染。中国的大气、水体、生物等各种环境样品中已广泛检出了PAEs[1-3] 。它在人和动物体内起着类似雌性激素的作用,可导致 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
内分泌紊乱、生殖机能失常等。高浓度DEHP对器官的危害、 对血液系统的影响、对生殖系统的影响、具有致癌性[4]。
在土壤环境中的抗生素残留尽管较低 ,但对环境中的微生物抗性 、动物和植物产生的生态毒性效应及其在环境中引起的耐药性也是不容忽视的。抗生素对土壤环境中微生物、动物 、 植物的生长发育均具有明显的抑制作用 。抗生素作为兽药和饲料添加剂被越来越广泛地应用于畜禽养殖和水产养殖[5]。据统计，从上世纪末到本世纪初的15 年间，美国兽药抗生素的使用量增加了109 倍[6]，其中60% ～ 80% 用作饲料添加剂[7]，其每年用于养殖业的抗生素达11 000 多吨, 占全国抗生素总用量的70%左右[8]。我国是世界上最大的抗生素生产国和消费国，从上世纪八十年代至本世纪初，仅磺胺类药物的生产由5 000 t 突破到了20 000 t[9]，并被广泛应用于畜禽养殖业中。随着畜禽养殖业的飞速发展，我国兽药抗生素的用量仍在不断增加，至2003 年，仅用作饲料添加剂的兽药抗生素年均用量已高达6 000 t[10]。在我国浙江北部地区，四环素在土壤中的浓度高达5.17 mg/kg，高出阈值50 多倍。有实验[11]表明如果将含4.0 mg/kg四环素和0.1 mg/kg金霉素的粪液施入土壤，会分别导致86.2 μg/kg和172 μg/kg 的残留。当前畜禽粪便的抗生素残留程度，不做任何处理直接作为有机肥农用，必然导致土壤的生态风险。我国每年大约有27 亿吨畜禽粪便作为有机肥使用[12]，将成为兽药抗生素进入土壤环境的重要途径。
酞酸酯类以及抗生素类通过多种进入农田土壤，导致土壤的复合污染，而通过测定土壤基础呼吸、微生物C和过氧化氢酶活性能够有效的评价土壤的健康状况，从而反映出土壤的污染程度，但迄今为止，利用具体土壤基础呼吸、微生物C、过氧化氢酶活性反映酞酸酯与抗生素复合污染土壤相关研究鲜有报道。因此，本研究在借鉴前人研究的基础上，通过向土壤中添加四环素和DEHP，室内模拟复合污染土壤。研究邻苯二甲酸(2-乙基己基酯)酞酸酯类化合物对菜园土壤脲酶活性的动态影响。为评价酞酸酯与抗生素复合污染土壤的生态毒理效应提供参考依据。
2 材料与方法
2.1 土壤
取自西边（淮安西南部）农家自留地0-20 cm土层，挑拣出石块与动植物残体，放置于暗处，自然阴干，用0.2 mm的筛子过筛成粉粒，以便将药品搅拌均匀。
对所取土样先分别测定土壤的基本理化性质：pH值，有机质，速效磷，速效钾，碱解氮，分别采用电位测定法，重铬酸钾法，Olsen法，醋酸铵－火焰光度法，碱解扩散法[13]。实验测定的土壤基本理化性质
pH值 有机质 (g/kg) 有效磷(mg/kg) 速效钾(mg/kg) 碱解氮(mg/kg)
土壤 7.62 14.44 116.67 52.36 57.3
2.2 主要试剂
1 四环素:盐酸四环素，南京奥多福尼生物科技有限公司生产
2 邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)：分析纯，南京化学试剂有限公司生产
3 氯仿取125 ml氯仿于250 ml分液漏斗，加50 ml蒸馏水洗3次，下层为氯仿，馏出液存放于棕色瓶中，重复操作，配制1400 ml，保存于冰箱
4 高锰酸钾：0.1 mo *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
l/L高锰酸钾溶液：3.161 g溶至1 L 棕色瓶保存于冰箱
5 硫酸钾溶液：87.1 g硫酸钾溶溶至1 L（每一次配置1500 ml）
6 重铬酸钾（0.4 mol/L）：19.622 g重铬酸钾溶至1 L
7 氧化汞
8 硫酸比上磷酸=2:1（每一次配制600 ml，硫酸400 ml、磷酸200 ml）
9 邻啡罗啉指示剂：1.49g溶于含有0.7 g FeSO47H2O的100 ml去离子水中，密闭保存于棕色瓶
10 硫酸亚铁：分析纯
11 氯化钡：分析纯
12 硫酸：分析纯
13 氢氧化钠：分析纯
14 过氧化氢：30%浓度
2.3 主要仪器
1 恒温培养箱
2 往复式震荡机
3 真空泵
4 消煮炉
2.4 实验设计
称25 kg两种供试土2份,分别加入0.2 g、1.0 g DEHP从而形成10 mg/kg、50 mg/kg,2个梯度的处理。再将土壤分成5kg每份，配取四环素溶液0.5g/L。再分别取0 ml、1.0 ml、5.0 ml、10.0 ml、50.0 ml定容至1L，加入土壤充分混合拌匀，四环素含量0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、5.0 mg/L，含水量为20%。
（1）土壤 + 0.00 mg/kg 四环素 + 10 mg/kg DEHP
（2）土壤 + 0.10 mg/kg 四环素 + 10 mg/kg DEHP
（3）土壤 + 0.50 mg/kg 四环素 + 10 mg/kg DEHP
（4）土壤 + 1.00 mg/kg 四环素 + 10 mg/kg DEHP
（5）土壤 + 5.00 mg/kg 四环素 + 10 mg/kg DEHP
（6）土壤 + 0.00mg/kg 四环素 + 50 mg/kg DEHP
1 引言 1
2 材料与方法 2
2.1 土壤 2
2.2 主要试剂 2
2.3 主要仪器 3
2.4 实验设计 3
2.5 测定内容 4
3 结果 4
3.1 土壤基础呼吸强度 4
3.2 土壤微生物量C 10
3.3 过氧化氢酶 14
4 讨论 17
结论 19
致谢 20
参考文献 21
1 引言
全球邻苯二甲酸酯类化合物（Phthalic acid esters, PAEs）的污染已经超过了DDT(二氯二苯三氯乙烷) 和BHC(六氯环己烷) ,成为环境科学工作者研究的重要有机污染物之一。邻苯二甲酸二异辛酯(di-(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP)是有毒的化工用塑料软化剂，属无色，无味液体，添加后可让微力分子更均匀散步，从而增加延展性，弹性和柔软度，故在工业用途上，DEHP是塑化剂最主要的一种被普遍应用于橡胶管及塑料薄膜润滑剂、润滑油和去污剂等数百种产品的生产中。美国环保局（EPA ）将6 种邻苯二甲酸酯类化合物列入129种重点控制的污染物名单中,包括邻苯二甲酸二甲酯(DMP) 、邻苯二甲酸二乙酯(DEP) 、邻苯二甲酸二丁酯(DBP) 、邻苯二甲酸二辛酯(DOP) 、邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP) 和邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP) 。这些酞酸酯与塑料分子由氢键或范德华力联接,彼此间保留各自相对独立的化学性质,因此随着使用时间的推移,这些酞酸酯可从塑料中转移到环境中,造成环境的污染。中国的大气、水体、生物等各种环境样品中已广泛检出了PAEs[1-3] 。它在人和动物体内起着类似雌性激素的作用,可导致 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
内分泌紊乱、生殖机能失常等。高浓度DEHP对器官的危害、 对血液系统的影响、对生殖系统的影响、具有致癌性[4]。
在土壤环境中的抗生素残留尽管较低 ,但对环境中的微生物抗性 、动物和植物产生的生态毒性效应及其在环境中引起的耐药性也是不容忽视的。抗生素对土壤环境中微生物、动物 、 植物的生长发育均具有明显的抑制作用 。抗生素作为兽药和饲料添加剂被越来越广泛地应用于畜禽养殖和水产养殖[5]。据统计，从上世纪末到本世纪初的15 年间，美国兽药抗生素的使用量增加了109 倍[6]，其中60% ～ 80% 用作饲料添加剂[7]，其每年用于养殖业的抗生素达11 000 多吨, 占全国抗生素总用量的70%左右[8]。我国是世界上最大的抗生素生产国和消费国，从上世纪八十年代至本世纪初，仅磺胺类药物的生产由5 000 t 突破到了20 000 t[9]，并被广泛应用于畜禽养殖业中。随着畜禽养殖业的飞速发展，我国兽药抗生素的用量仍在不断增加，至2003 年，仅用作饲料添加剂的兽药抗生素年均用量已高达6 000 t[10]。在我国浙江北部地区，四环素在土壤中的浓度高达5.17 mg/kg，高出阈值50 多倍。有实验[11]表明如果将含4.0 mg/kg四环素和0.1 mg/kg金霉素的粪液施入土壤，会分别导致86.2 μg/kg和172 μg/kg 的残留。当前畜禽粪便的抗生素残留程度，不做任何处理直接作为有机肥农用，必然导致土壤的生态风险。我国每年大约有27 亿吨畜禽粪便作为有机肥使用[12]，将成为兽药抗生素进入土壤环境的重要途径。
酞酸酯类以及抗生素类通过多种进入农田土壤，导致土壤的复合污染，而通过测定土壤基础呼吸、微生物C和过氧化氢酶活性能够有效的评价土壤的健康状况，从而反映出土壤的污染程度，但迄今为止，利用具体土壤基础呼吸、微生物C、过氧化氢酶活性反映酞酸酯与抗生素复合污染土壤相关研究鲜有报道。因此，本研究在借鉴前人研究的基础上，通过向土壤中添加四环素和DEHP，室内模拟复合污染土壤。研究邻苯二甲酸(2-乙基己基酯)酞酸酯类化合物对菜园土壤脲酶活性的动态影响。为评价酞酸酯与抗生素复合污染土壤的生态毒理效应提供参考依据。
2 材料与方法
2.1 土壤
取自西边（淮安西南部）农家自留地0-20 cm土层，挑拣出石块与动植物残体，放置于暗处，自然阴干，用0.2 mm的筛子过筛成粉粒，以便将药品搅拌均匀。
对所取土样先分别测定土壤的基本理化性质：pH值，有机质，速效磷，速效钾，碱解氮，分别采用电位测定法，重铬酸钾法，Olsen法，醋酸铵－火焰光度法，碱解扩散法[13]。实验测定的土壤基本理化性质
pH值 有机质 (g/kg) 有效磷(mg/kg) 速效钾(mg/kg) 碱解氮(mg/kg)
土壤 7.62 14.44 116.67 52.36 57.3
2.2 主要试剂
1 四环素:盐酸四环素，南京奥多福尼生物科技有限公司生产
2 邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)：分析纯，南京化学试剂有限公司生产
3 氯仿取125 ml氯仿于250 ml分液漏斗，加50 ml蒸馏水洗3次，下层为氯仿，馏出液存放于棕色瓶中，重复操作，配制1400 ml，保存于冰箱
4 高锰酸钾：0.1 mo *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
l/L高锰酸钾溶液：3.161 g溶至1 L 棕色瓶保存于冰箱
5 硫酸钾溶液：87.1 g硫酸钾溶溶至1 L（每一次配置1500 ml）
6 重铬酸钾（0.4 mol/L）：19.622 g重铬酸钾溶至1 L
7 氧化汞
8 硫酸比上磷酸=2:1（每一次配制600 ml，硫酸400 ml、磷酸200 ml）
9 邻啡罗啉指示剂：1.49g溶于含有0.7 g FeSO47H2O的100 ml去离子水中，密闭保存于棕色瓶
10 硫酸亚铁：分析纯
11 氯化钡：分析纯
12 硫酸：分析纯
13 氢氧化钠：分析纯
14 过氧化氢：30%浓度
2.3 主要仪器
1 恒温培养箱
2 往复式震荡机
3 真空泵
4 消煮炉
2.4 实验设计
称25 kg两种供试土2份,分别加入0.2 g、1.0 g DEHP从而形成10 mg/kg、50 mg/kg,2个梯度的处理。再将土壤分成5kg每份，配取四环素溶液0.5g/L。再分别取0 ml、1.0 ml、5.0 ml、10.0 ml、50.0 ml定容至1L，加入土壤充分混合拌匀，四环素含量0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、5.0 mg/L，含水量为20%。
（1）土壤 + 0.00 mg/kg 四环素 + 10 mg/kg DEHP
（2）土壤 + 0.10 mg/kg 四环素 + 10 mg/kg DEHP
（3）土壤 + 0.50 mg/kg 四环素 + 10 mg/kg DEHP
（4）土壤 + 1.00 mg/kg 四环素 + 10 mg/kg DEHP
（5）土壤 + 5.00 mg/kg 四环素 + 10 mg/kg DEHP
（6）土壤 + 0.00mg/kg 四环素 + 50 mg/kg DEHP
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