葡萄果实乙烯信号转导途径的初步研究
摘 要：乙烯在葡萄果实生长发育过程中起到至关重要的作用。在这个实验中我们利用转录组测序（RNA-seq）技术从全基因组水平分析了‘藤稔’葡萄在第一生长周期（花后40天）、转色期（花后65天）和成熟期（花后90天）中果实生长发育相关的差异基因。DAF65与DAF40果实相比差异表达基因数目为5620个，上调957个，下调的是4,663个。DAF90与DAF40果实相比差异基因总数为5,196个，其中上调1,340个，下调3,856个。DAF90与DAF65果实相比差异基因总数为3,381个，其中上调2,035个，下调的是1,346个。对差异表达的基因进行GO分析和Pathway分析，发现葡萄果实发育乙烯信号转导途径相关的差异表达基因在葡萄果实第一生长周期表达量较高，而在转色期表达量最低，该结果可为今后研究葡萄生长发育过程中乙烯调控提供理论参考。关键字：葡萄；果实发育；基因；差异表达；乙烯A preliminary study on the ethylene signal transduction pathway of grapeHorticulture ZepinHe Tutor HaifengJiaABSTRACT: Ethylene play a crucial role in the growth and development of grape fruit. In this experiment, we use transcriptome sequencing (RNA-seq) technology from a genome-wide analysis of the Fujiminori grape first growth period (40 days after flowering), veraison (65 days after flowering) and at maturity (90 days after flowering) of fruit growth and development related to the differential gene. DAF65 and DAF40 fruit compared to the number of differentially expressed genes 5620, u
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p 957, down is 4,663 points. DAF90 difference compared with the total number of genes as the fruit DAF40 5,196, which raised 1,340, down 3,856 points. DAF90 fruit and DAF65 difference compared to 3,381 the total number of genes, including a 2,035 increase, a reduction is 1,346. Genes differentially expressed GO analysis and Pathway analysis found that fruit development ethylene signal transduction pathway associated differentially expressed genes in the growth cycle of grapes first high expression level, while the lowest expression of veraison, the results can be grape future growth and development regulation ethylene theoretical reference.KEYWORDS: grape; development; gene; different expression; ethylene引言：葡萄果实在授粉受精后开始发育，经过细胞分裂和膨大，最终形成种子并成熟的动态过程[1]果实的成熟过程经历了一系列特殊的生理生化变化过程，涉及细胞壁的修饰、淀粉向糖的转化、色素的合成、芳香物质的积累和多酚类物质及抗氧化系统的变化等[2]，这些过程不仅受到如基因表达、生长发育阶段等因素的调控，还受到内源激素的调控。葡萄作为一种常见的果实可直接工人使用也可用作葡萄干葡萄酒等的原料具有较高的经济价值，其果实发育和成熟过程的研究就显得尤为重要。葡萄浆果的生长表现为双S型曲线，分为3个生长阶段：第一生长周期、停滞期和第二生长周期。在第一生长周期，浆果中大多数的化合物、矿物质、氨基酸、微量元素等都随着浆果体积的增大而积累，并在转色期达到表观最大值。停滞期也叫硬核期，这一时期整个浆果的生长速度明显减缓。这一时期葡萄浆果纵横径基本不增大，主要进行种胚的发育和种皮的硬化，浆果酸度达最高水平，并开始了糖的积累。此期结束的标志是浆果开始退绿变软，因此这个转折点也叫转色期（veraison），这是浆果发育进入第二生长周期、浆果成熟期的信号。在转色期中葡萄浆果的风味形成主要决定于糖酸比的平衡、风味物质和芳香族化合物的合成或一些前体的形成。葡萄浆果在停滞期发生的这一系列特征变化在很大程度上决定了浆果成熟时的品质[3]。随着葡萄浆果颜色的变化和硬度的降低，浆果再次生长，进入第二生长周期。浆果中的含糖量急剧上升，含酸量迅速下降，其中主要是苹果酸的减少。单宁的含量也有了显著的降低。虽然在浆果的第一生长周期化合物发生了重要变化，但更重要的是化合物含量在第二生长周期发生了重大的提高（主要是葡萄糖和果糖），使得果实从总生化反应转入果实成熟模式。尽管关于葡萄果实重要三个生长时期的生理与生化研究较为清楚，但基因水平上到底有多少乙烯信号转导途径相关基因及生物网络直接或间接参与仍需进一步研究。葡萄基因组测序的完成[4]为葡萄基因组的认识提供了研究手段与重要信息。新一代Illumina高通量测序技术（RNA-Seq技术），能从单核苷酸对特定物种的整体转录活动进行检测[5][6]，从而快速全面获得该物种在某一特定状态下几乎所有转录本的信息[7]。不同于传统的芯片、SSR等差异显示技术，基于RNA-Seq技术的数字基因表达谱在mRNA差异筛选方而显示出强大的优势，它无需对数据集进行复杂的标准化便可以提供不同样品间基因差异表达的“数字化测量”[8][9][10]。由于转求组测序可以得到RNA转录本的丰度信息，使其具有十分广泛的应用前景[11] [12]。基于RNA-Seq获得的序列和表达量信息有助于构建动态的基因变化网络，为相关机制的探明提供线索。近年来，虽然RNA-Seq技术已被应用到葡萄上[13]，但还需要更详细的研究去了解浆果发育过程中复杂的基因表达变化。在本文中，我们利用转录组测序技术从全基因组水平揭示‘藤稔’葡萄在第一生长周期（花后40天）、转色期（花后65天）和成熟期（花后90天）中果实生长发育乙烯相关基因的表达与调控的分子机制并利用对葡萄转录组中重要差异表达基因进行qRT-PCR验证。1材料与方法1.1 材料1.1.1植物材料‘藤稔’葡萄（Vitis labruscana cv. ‘Fujiminori’）果实均采自于大学江浦实验基地。采样的时间为花后40d、65d和90d。所有样品采集后立即在液氮中速冻并贮于-70 ℃冰箱中备用。1.1.2 化学试剂大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α由本实验室保存；pMD19-T simple载体购自TaKaRa公司。DEPC为Ameresco产品；水饱和酚、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）为BASF产品；β-硫基乙醇、SDS为Sigma产品；荧光定量染料SYBR? Green I、dNTP（10mM）、Ex-Taq酶、RNA酶抑制剂和RNase Free DNaseⅠ购自日本TaKaRa公司；Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）购自Ambion公司（Ambion, Austin, TX）；Axygen DNA回收试剂盒、DL 2000 Plus DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；常规化学药品及试剂购自Sigma公司或为国产AR级试剂。cDNA合成、由上海捷瑞生物技术有限公司合成，定量引物由北京鼎国生物技术有限公司合成，其编号及序列见表1-1。表1-1引物序列序列IDSeq ID引物（3‘-5’）Primer （3‘-5’）引物（5‘-3’）Primer R（5‘-3’）VIT_02s0025g00360.t01GCTCATCCTTCCATTGCTCGTGGCAGACACCTCCTTTTCTVIT_11s0016g02380.t01TCTTGGTTTGGAGAAGGGCTCCCTAACAAGCTCAGGTCGAVIT_05s0049g00090.t01GTTGTTCTGAGAGGTGGGGACACACCGGATTCCAAACCAGVIT_08s0040g01730.t01AGATTTCTGGAAGCAGCCCTGACCCAACCCAGCTAGTCTTVIT_06s0004g01610.t01GGAGGATGGCAGAATTCACGCCACAGGTCTATCTTGCCCAVIT_11s0016g05410.t01CCTGCCGGGGTATAACAGATATTGCAGGCCCTCAAGAGATVIT_17s0000g02230.t01CGTCCCTTTGCATCATCTGGVGGCTTCCCACTTGCTTTTCAVIT_02s0012g01320.t01GGTGGTGGTGGAGATTCTGATTTGCAGGTTTTCTCCCACGVIT_01s0010g02750.t01CAAAGATCTCCGGCGTGAAGGATCCTCGCTCTTGTCAGGAVIT_03s0063g01820.t01GTCCTCCTCGACTCCATCAGTCGGAAGGGTCGAGATATGCVIT_14s0083g00110.t01CTTCCTCGTTCAAGCTGCTCGTGAGGTTGTGGGATGGAGAVIT_10s0042g01250.t01GTGCTGTTAGTATCTGCCGCTTGACACATCTCCAGCCAGTVIT_11s0016g01990.t01GGCGGTTTTGGGGTATTTGTAGAGCACCTCCACCATGAAAVIT_08s0007g06160.t01AAACGCCAGACCCTAAGACAGTGTGAGCTTGATCCTGCTGVIT_07s0031g01320.t01CAGATTAGCACGTGGGGAGATCAGAAGGTCCAGGTGTTCCVIT_03s0088g00700.t01AGTTGGCGTTGGGTCTATGACTGTCAATGAACCACTGCCCVIT_08s0040g01710.t01GGATCAACACCCTCCTCCAAAGAGGCAAGCTTGGAGTGATVIT_07s0031g01850.t01TGCTTCAGAACTGGGAGGAGATCGAAGCTCCGCATTCAACVIT_18s0001g10690.t01CCTCCACCACAATCCCAGATGTGGAGGAGCGAGGAGATACVIT_02s0025g03550.t01ATTGCGGGTTCTCTGTGGTAACAATACCCTCAACACCGGTVIT_14s0083g01110.t01CTCCATGACCACCCAAGAGTTCAAAGATCACAGCTCGGGTVIT_19s0085g00830.t01GTTGGTCTGGGCTTTGAAGGATTCACACACTCCGGGAAGTVIT_18s0001g11320.t01TGTTCGGTATGCGCATGAAGTTCAGGCTTCCACTCCTCAGVIT_19s0140g00140.t01GGAGAACACACAGACCCTCAAGAAGGAGTTGGCATCAGGTVIT_01s0011g05260.t01GGACAACACCGATCATCTGCCGTCGAGATCTGCCAAACTGVIT_16s0050g02620.t01TGATGGTTGTTGTTGCCGTTCCGAATGTACTCCGACTCCAVIT_13s0175g00120.t01GGAGTTGTCGCTGAACCATCCGGAAATTGTGGTTGTGGGTVIT_07s0031g00620.t01TAGTTCAGTGCAGCCTTCGACACCCTCTTCTTTTGCCCACVIT_19s0093g00550.t01AAACTGCTCTCTCCACTCCCATTGCGGTGAGACAGAGGAAVIT_07s0104g00270.t01GTGGAGAAGGGAATGGTGGATCTTCGTCCAGGAAACCCTCVIT_04s0008g01880.t01GACGAGGTTTGTGGAGAGGACCATCCATCCATCGTCCTCAVIT_05s0020g02210.t01ATGGAGGTGGTTCAGATGCACAGGGTTGCTCTCATCTTGCVIT_01s0011g05830.t01TCGGTGTCATCTTGCTCAGTAGAGCCCTGGATATCGCAAAVIT_17s0000g07580.t01CTGACTCGCATTGACAGGTGCCTCTCCCTCTTCCTCTCCTVIT_13s0067g00330.t01TGGACAAGAGGACATGGACCCAGGGCTGCAATGGTCAAATVIT_09s0002g05150.t01AACCCTAGCTCTACCTCCCACCAGCAAGGTGGTTTGAGTCVIT_01s0244g00150.t01GTTGAGGAGGCATGCTGATGATCGCCACTCATTTCCATGCVIT_18s0001g02610.t01GAGATTGTACGGCGTTGGACCAAGTGGTACCAGCTCTCCAVIT_07s0104g01250.t01AGCATCAGAGGCAGTGAAGTCATGAGCCTTGCAAACCCATVIT_17s0000g08990.t01GAGATCCAGCGTCGTGAAACAGAGACAGACGTTGAAGGCA1.2 方法 1.2.1总RNA提取、纯化及cDNA文库构建从样本中提取总RNA，使用2100 Bioanalyzer对总RNA进行质检。利用DNaseI （TaKaRa，日本）对合格RNA进行37℃消化30 min。DNase消化后的RNA利用Dynabeads? Oligo （dT）25（Life，美国）进行mRNA纯化。用NEBNext? UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，美国）构建cDNA文库。1.2.2转录组测序分析转录组测序工作由上海翰宇生物科技有限公司完成。取10 ng的文库，用TruSeq PE Cluster Kit（illumina，美国）在cBot中进行cluster generation，然后在Illumina HiseqTM2500中进行双向测序。1.2.2.1数据过滤为保证信息分析质量，必须对原始数据中含有带接头的、低质量的reads过滤，得到clean reads。使用的软件为FASTX-Toolki（http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/）。数据处理的步骤：1) 使用fastx_clipper去除reads中的接头序列；2) 使用fastq_quality_filter从read 3’到5’方向开始去除N（N表示无法确定碱基信息）至第一个不是N的碱基；3) 使用fastq_quality_filter从read 3’到5’方向开始去除连续出现的低质量碱基，当去除低质量的clean reads长度低于40bp时删除read本身及其配对的序列；4) 使用本地脚本配对pair end reads（PE测序使用）。1.2.2.2测序饱和度、测序覆盖度及测序覆盖深度分析 测序饱和度分析是用来衡量一个样品的测序量多少的标准，随着测序量（reads数量）的增多，检测到的基因数也随之上升，当测序量达到某个值时，其检测到的基因数增长速度趋于平缓，说明检测到的基因数趋于饱和。基因覆盖度指每个基因被reads覆盖的百分比，其值等于基因中unique mapping reads覆盖的碱基数跟基因所有碱基数的比值。1.2.2.3差异表达基因的筛选将测序序列mapping到预测基因上，统计每个基因中分别来自2个样品的reads数目，并转换成RPKM[8]，利用DEGseq程序包中的MARS （MA-plot-based method with Random sampling model）模型[11]，计算每个基因在2个样品中的表达丰度差异，FDR值小于0.001且倍数差异不低于2倍的基因的即被认定为具有显著性差异。1.2.2.4 差异基因GO、Pathway显著性富集分析GO功能显著性富集分析首先把所有差异表达基因向Gene Ontology数据库（http://www.geneontology.org/）的各term映射，计算每个term的基因数目，然后再利用超几何分布统计计算出对每一个代谢通路和GO类别具有显著性表达差异的基因相对全部基因的显著富集情况。在生物体内，不同基因相互协调行使其生物学功能，基于Pathway的分析有助于更进一步了解基因的生物学功能。KEGG是有关pathway的主要公共数据库[14]。Pathway显著性富集分析以KEGG Pathway为单位，应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在差异表达基因中显著性富集的Pathway。1.2.3 qRT-PCR分析基因表达通过qRT-PCR技术对‘藤稔’葡萄果实发育过程中差异表达候选基因进行的表达情况进行验证。分别取2μgRNA以P01和P02引物反转录合成cDNA，以葡萄Actin基因（NCBI登录号：AF369524）为内参进行定量PCR，目的基因的引物及片段大小见表1-2。各种引物由北京鼎国生物技术有限公司合成。表1-2 引物序列及用途编号Code No序列Sequence (5-3)用途UseP01GCAGGACTGCAGCTGACTGACTACT30VNcDNA合成P02GACCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGcDNA synthesisVvACO1-1302-1GAAGATCTTCATGAAGGAATTCACCGCGCApCAMBIA-1302VvACO1-1302-2GGACTAGTCCAACTGTGGCAATGGGACCVvERF-1302-1GAAGATCTTCATGGATTCTTCTTCCTTCTATCATCpCAMBIA-1302VvERF -1302-2GGACTAGTCCTGATGAACACAAGAGTTGCTCCPpACO1-1302-1ATCATGCCATGGCATGGGAGAACTTCCCAATCATCAACpCAMBIA-1302PpACO1-1302-2GGACTAGTCCAGCTGTTGCAATTGGACCCAAPpEIN3-1302-1GAAGATCTTCATGGGTTTCTGTGGTAATCTTGATpCAMBIA-1302PpEIN3-1302-2GGACTAGTCCGATCCAAAATGCATCTTGCTTCVvACO1-TRV-1CGCGGATCCGCGATGAAGGAATTCACCGCGCApTRV2VvACO1-TRV-2CCGCTCGAGCGGTCAAACTGTGGCAATGGGACCVvERF-TRV-1CGGGATCCCGATGGATTCTTCTTCCTTCTATCATCpTRV2VvERF- TRV-2CCGCTCGAGCGGTGATGAACACAAGAGTTGCTCCPpACO1-TRV-1CGGGATCCCGATGGAGAACTTCCCAATCATCAACpTRV2PpACO1- TRV-2GCTCTAGAGCAGCTGTTGCAATTGGACCCAAPpEIN3-TRV-1CGGGATCCCGATGGGTTTCTGTGGTAATCTTGATpTRV2PpEIN3- TRV-2GCTCTAGAGCGATCCAAAATGCATCTTGCTTCActin-1CCCCATGCTATCCTTCGActin 扩增Actin-2AGGCAGCTCATAGTTCTTCTCActin amplificationVvACO1-1TGTCATCAACCTAGGTGATCAGC半定量RT-PCRVvACO1-2GCTTCATGTAGTCCTCAAACACGSemi-Quantitative RT-PCRVvERF-1GTATAGGGGTGTCAGGAAGCG半定量RT-PCRVvERF-1CAGGCGTACTTGATGTCCCTTSemi-Quantitative RT-PCRPpACO1-1TGCGCCATCTTCCAAAATCTA半定量RT-PCRPpACO1-2GGTACCCTTGTTCAAGTCCAASemi-Quantitative RT-PCRPpEIN3-1ACAATCAGCGGTACCAGTGA半定量RT-PCRPpEIN3-2GCATCATCTGTGGCTCTTCGSemi-Quantitative RT-PCRTRV1-1TTACAGGTATTTGGGCTAGTRV1扩增TRV1-2CCGGGTTCAATTCCTTATCTRV1 amplificationTRV2-1TTACGACGAACCAAGGGAGTACTACTRV2扩增TRV2-2AGCACAATTAGCCCTATTTAGATGTTRV2 amplificationLeACO1-1AGGAGGCATCATACTTCTGTTC定量RT-PCRLeACO1-2ACAATAGAGTGGCGCATGGGAQuantitative RT-PCRLeERF-1TGCTCTATGACCTTCTCGCA定量RT-PCRLeERF-2ATCTCTAATCTCCGCCGCAAQuantitative RT-PCRLeEIN3-1TTTCAGCCCGATAAACAGCG定量RT-PCRLeEIN3-2CTTAGCCTGTGACTCCTCGTQuantitative RT-PCR利用ABI PRISM 7500 real-time PCR system（Applied Biosystems, USA）荧光定量PCR仪进行实时荧光定量RCR分析。反应体系按SYBR? Green I（TaKaRa）说明书进行，其优化后的反应条件为：95℃预变性60 s，95℃ 15 s、59.6℃ 15 s，72℃ 20 s、40个循环，试验设置3次重复。利用7500 System software version 2.0.5软件对扩增曲线和溶解曲线进行分析，验证引物的特异性及扩增条件，确定合适的阈值和Ct值，利用2－ΔΔCt方法相对定量各基因与内参Actin表达量的差异。2 结果与分析2.1测序质量评估2.1.1 Reads整体质量评估从表2-1的Read分布可知，所测序分析的样本，最终得到的Clean Read的数量都占总测序的96%以上，仅少数是只有接头序列或包含未知碱基序列的Reads。与参考基因的比对数达到64%以上，利于数据分析。表2-1 葡萄三个时期样品与参考基因比对统计结果Map to GeneDAF40DAF65DAF90Raw Reads298599352824148726473446Clean Reads28808716 (96.48%)27841132 (98.94%)25457565 (96.22%)rawdata5.69G5.97G5.65Gcleandata5.63G5.76G5.59GTotal mapped(percent of clean reads)18543240 (64.37%)21785051 (77.97%)20675429 (81.22%)Unique_match(percent of clean reads)16171753 (56.13%)18888870 (67.60%)17462185 (68.59%)Mutliple_match(percent of clean reads)2371487 (8.23%)2896181 (10.37%)3213244 (12.62%)Total unmapped(percent of clean reads)10265476 (35.63%)6156081 (22.03%)4782136 (18.78%)2.1.2差异表达基因的筛选所有clean reads经过参考基因库进行注释之后，对不同样品的基因进行比对，筛选差异基因。设定FDR≤0.001和|log2Ratio|≥1作为阈值来判断基因是否在两个样品中差异表达。通过对比分析选出大量在‘藤稔’果实发育过程中差异表达的基因（图2-1）。其中，DAF65与DAF40果实相比差异表达基因数目为5620个，上调957个，下调的是4663个。DAF90与DAF40果实相比差异基因总数为5196，其中上调1340个，下调3856个。DAF90与DAF65果实相比差异基因总数为3381个，其中上调2035个，下调的是1346个。图2-1 ‘藤稔’不同发育时期果实差异表达基因的统计2.1.3 GO功能显著性分析GO基因功能分类体系可分为基因的分子功能（molecular function）、参与的生物过程（biological process）、构成的细胞组成（cellular component）。基于序列同源性，对DAF65与DAF40的5620个差异基因进行GO富集分析，共有2584个转录本注释到GO途径，且分为49个功能组；对DAF90与DAF40的5196个差异基因进行GO富集分析，共有2474个转录本注释到GO途径，且分为49个功能组；对DAF90与DAF65的3381个差异基因进行GO富集分析，共有1623个转录本注释到GO途径，且分为50个功能组。由图4-2可知，1）参与的分子功能中：分子结合（binding）和催化活性（catalytic activity） 两个分类数量最多；2）参与生物过程中：代谢过程（metabolic process）和细胞生理过程（cellular process）两个分类数量最多；3）构成细胞组分的9个种类中：细胞（cell）和细胞部分（cell part）两个分类数量最多（图2-2）。图2-2葡萄三个不同发育时间浆果差异表达基因的Go Ontology分类2.1.4Pathway显著性富集分析KEGG数据库能够系统分析基因产物所参与的代谢途径及其功能。我们对三个样品的差异表达基因进行Pathway富集，最后将DAF90/DAF65和DAF65/DAF40的差异基因其归入32个KEGG途径，将DAF90/DAF40的差异基因归入31个KEGG途径（图4-3）。包括糖代谢、翻译、氨基酸代谢、信号转导、脂代谢、能量代谢、环境适应、次生代谢产物的生物合成等主要代谢途径。其中包含差异基因最多的三个途径是糖代谢途径、信号转导和氨基酸代谢途径 （图2-3）。图2-3 差异表达基因的Pathway富集分析2.2 乙烯代谢相关基因在‘藤稔’果实发育过程中的研究乙烯对果实发育和成熟具有重要作用，能够增加浆果直径、加速果实成熟、促进花青素生物合成基因的表达和积累。抑制乙烯能够延缓果实成熟。大量研究表明，乙烯的生物学效应是通过乙烯信号转导途径得以实现的 [15][16]。在此研究中，我们以RPKM（Reads Per Kilobase of exon per Million）值的大小对果实转录表达水平进行评估[8]。在DAF40、DAF65、DAF90三个时期的葡萄果实中共鉴定出21个差异表达基因响应乙烯生物合成及信号转导途径（附表1）。其中乙烯生物合成途径中鉴定到3个SAMS差异表达基因（VIT_08s0007g05000.t01、VIT_07s0005g02230.t01、VIT_14s0060g00480.t01）、1个ACS差异表达基因（VIT_02s0025g00360.t01）和3个ACO差异表达基因（VIT_12s0059g01380.t01、VIT_11s0016g02380.t01、VIT_00s2086g00010.t01）。在信号转导途径中分别鉴定到4个乙烯受体（VIT_07s0005g00850.t01、VIT_05s0049g00090.t01、VIT_14s0081g00630.t01、VIT_06s0004g05240.t01）和ERF（VIT_05s0049g00510.t01、VIT_07s0005g03230.t01、VIT_07s0005g03260.t01、VIT_14s0081g00730.t01），2个EBF1/2（VIT_04s0008g05470.t01、VIT_11s0016g05410.t01），1个CTR1（VIT_08s0007g03910.t01）、MPK6（VIT_13s0074g00430.t01）、EIN2（VIT_08s0040g01730.t01）和EIN3（VIT_06s0004g01610.t01）差异表达基因。图2-4 果实发育不同时期乙烯生物合成及信号转导途径相关基因转录水平变化SAM：腺苷蛋氨酸合成酶；ACS：1- 氨基环丙烷- 1- 羧酸合成酶；ACO：1- 氨基环丙烷- 1- 羧酸氧化酶；ETR：乙烯受体；CTR1：乙烯三重反应元件；MPK6：蛋白激酶；EIN2：乙烯不敏感蛋白2；EIN3：乙烯不敏感蛋白3；EBF1/2：结合EIN3的F-box蛋白；ERF：乙烯反应元件；基因柱形图下方的数字表示在果实不同发育时期差异表达的基因数目从整个乙烯合成和信号转导网络途径来看（图2-4），大部分基因在第一生长周期（DAF40）表达水平最高，随后在转色期（DAF65）降低，而在成熟期（DAF90）各基因的表达水平又再次上升。但其中一个ACO基因（VIT_11s0016g02380.t01）的表达情况与此相反，在转色期表达水平最高，在第一生长周期表达水平最低。鉴定到的4个ERF基因中也有一个基因（VIT_05s0049g00510.t01）在第一生长周期表达水平最低。这说明同一基因家族不同成员在果实生长发育过程中调控作用不同，而葡萄果实乙烯相关基因转录水平在转色期的下降可能意味着葡萄在果实发育的早期对乙烯更敏感。2.3 qRT-PCR验证基因表达为了验证葡萄转录组测序数据的准确性和重复性，随机挑选了40个差异表达基因利用qRT-PCR技术对转录组数据进行验证。40个基因涉及8种不同激素的合成和信号转导途径。将qRT-PCR与转录组数据对比结果表明，只有VIT_05s0020g02210.t01、VIT_13s0175g00120.t01、VIT_08s0040g01710.t01和VIT_11s0016g05410.t01四个基因表达模式与转录组数据有差异，其余36个基因表达模式与转录组数据数据一致，准确率达90%，表明转录组数据具有较高的准确性（图2-5,表1-1）。图2-5 qRT-PCR验证转录组差异表达基因数据3 讨论RNA-Seq技术能够准确确定RNA的表达水平，并对实验结果直接进行比较。RNA-Seq可以捕捉组织不同状态下的转录组动态变化，并不需要对对数据集进行复杂的标准化[17][18][8]。在本研究中，利用RNA-Seq技术获得‘藤稔’葡萄不同发育时期果实的表达谱，发掘并分析了乙烯相关基因的表达情况。这为研究葡萄果实发育过程中激素的动态变化提供了依据。果实成熟是一个高度协调、基因程控和不可逆转的生物学过程，包含生理、生化和影响感官等一系列的变化，以形成可食用的成熟果实。植物激素（plant hormones）是植物体内合成的对植物生长发育有显著作用的几类微量有机物质，也被称为植物内源激素。植物激素是在低浓度时可调节植物生理反应的活性物质，由植物细胞接受特定环境信号诱导产生，在植物的生长过程中扮演极其重要的角色。它们在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发以及离体组织培养等方面，分别或相互协调地进行着调控。本研究对差异表达的基因进行GO分析和Pathway分析，发现葡萄果实发育中乙烯信号转导途径相关的差异表达基因所占比例，进一步对乙烯合成及信号转导网络分析，发现与乙烯代谢相关的基因在葡萄果实第一生长周期表达量较高，而在转色期表达量最低。这说明大量乙烯合成及信号转导相关基因参与到果实生长发育的过程中，而这些基因在葡萄生长发育过程中大都是时空特异性表达，它们可能参与特定发育时期的生理生化过程。藤稔’葡萄果实成熟过程中乙烯相关基因的分析。每个发育时期的样本，能够比对到参考序列上的总reads条数都在64%以上。DAF65与DAF40果实相比差异表达基因数目为5,620，上调957个，下调的是4,663个。DAF90与DAF40果实相比差异基因总数为5,196，其中上调1,340个，下调3,856个。DAF90与DAF65果实相比差异基因总数为3,381个，其中上调2,035个，下调的是1,346个。对差异表达的基因进行GO分析和Pathway分析，发现葡萄果实发育涉及到乙烯相关基因中信号转导途径中相关基因的表达差异，发现乙烯代谢的基因在葡萄果实第一生长周期表达量较高，而在转色期表达量最低。致谢首先感谢导师贾海峰不仅在实验研究中帮助我很多，而且也是我的心灵导师。还有我的师兄赵鹏程，帮助我解答实验中不太懂的知识且帮助我修改了论文。最后感谢我的父母养育我理解我。参考文献[1]Vvedenskaya IO, Vorsa N. Flavonoid composition over fruit development and maturation in American cranberry, Vaccinium macrocarpon Ait [J]. Plant Science, 2004, 167: 1043-1054[2]Ziosi V, Scaramagli S, Bregoli AM, et al. Peach (Prunus persicaL.) fruit growth and ripening: transcript levels and activity of polyamine biosynthetic enzymes in the mesocarp [J]. Journal of Plant Physiology, 2003, 160: 1109-1115[3]Ferreira V, Peoa C, Escudero A, et al. Investigation on the role played by fermentation esters in the aroma of young Spanish wines by multivariate analysis [J]. Journal of Food Agriculture and Environment, 1995, 67: 381-392[4]Jaillon O, Aury JM, Noel B, et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla [J]. Nature, 2007, 449: 463-467[5]Marioni JC, Mason CE, Mane SM, et al. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays [J]. Genome Research, 2008, 18: 1509-1517[6]Wilhelm BT, Marguerat S, Goodhead I et al. Defining transcribed regions using RNA-seq [J]. Nature Protocols, 2010, 5: 255-266[7]Nagalakshmi U, Wang Z, Waem K et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing [J]. Science, 2008 ,320: 1344-1349[8]Mortazavi A, Williams BA, McCue K, et al. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq [J]. Nature Methods, 2008, 5: 621-628[9]Cloonan N, Forrest AR, Kolle G, et al. Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNAsequencing [J], Nature Methods, 2008, 5: 613-619 [10]Haas BJ, Zody MC. Advancing RNA-Seq analysis [J]. Nature Biotechnology, 2010, 28: 421-423[11]Wang L, Feng Z, Wang X et al. DEGseq: an R package for identifying differentially expressed genes from RNA-seq data [J]. Bioinformatics, 2010, 26: 136-138[12]Kim KH, Kang YJ, Kim DH, et al. RNA-Seq Analysis of a Soybean Near-Isogenic Line Carrying Bacterial Leaf Pustule-Resistant and-Susceptible Alleles [J]. DNA Research, 2011, 18: 483-497[13]Zenoni S, Ferrarini A, Giacomelli E, et al. Characterization of transcriptional complexity during berrydevelopment in Vitis vinifera using RNA-Seq [J]. Plant Physiology, 2010, 152: 1787-1795[14]Kanehisa, M, Araki M, Goto S, et al. KEGG for linking genomes to life and the environment [J]. Nucleic Acids Research, 2008, 36: D480-D484[15]Chen YF, Etheridge N, Schaller GE. Ethylene signal transduction [J]. Annals of Botany, 2005, 95: 901-915[16]安丰英, 郭红卫. 乙烯信号转导的分子机制. 植物学通报, 2006, 23(5): 531-542.[17]Wilhelm BT, Marguerat S, Watt S, et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution [J]. Nature, 2008, 453: 1239-1243[18]Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics [J]. Nature Reviews Genetics, 2009, 10: 57-63 附表1表 1葡萄果实生长发育过程中差异表达的乙烯相关基因RefSeq 序列RefSeq Accession花后40天DAF40花后65天DAF65花后90天DAF90注释Annotaion功能FunctionVIT_08s0007g05000.t0146.07 26.44 176.85 metK; S-adenosylmethionine synthetase Ethylene biosynthesisVIT_07s0005g02230.t0194.43 39.00 26.14 metK; S-adenosylmethionine synthetase Ethylene biosynthesisVIT_14s0060g00480.t011029.61 337.67 220.91 metK; S-adenosylmethionine synthetase Ethylene biosynthesisVIT_02s0025g00360.t0150.64 3.00 6.18 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthaseEthylene biosynthesisVIT_12s0059g01380.t01201.61 45.13 99.65 aminocyclopropanecarboxylate oxidase Ethylene biosynthesisVIT_11s0016g02380.t012.57 284.82 68.04 aminocyclopropanecarboxylate oxidase Ethylene biosynthesisVIT_00s2086g00010.t01343.20 13.32 19.40 aminocyclopropanecarboxylate oxidase Ethylene biosynthesisVIT_07s0005g00850.t0146.92 7.52 19.32 ETR, ERS; ethylene receptor Ethylene responseVIT_05s0049g00090.t01109.48 29.39 39.75 ETR, ERS; ethylene receptor Ethylene responseVIT_14s0081g00630.t0116.21 5.05 11.75 ETR, ERS; ethylene receptor Ethylene responseVIT_06s0004g05240.t0118.50 0.01 0.70 ETR, ERS; ethylene receptor Ethylene responseVIT_08s0007g03910.t0110.66 3.68 7.67 CTR1; serine/threonine-protein kinase CTR1 Ethylene responseVIT_13s0074g00430.t0111.11 3.64 5.20 protein kinase domain containing protein, expressedEthylene responseVIT_08s0040g01730.t0122.02 10.53 27.43 EIN2; ethylene-insensitive protein 2Ethylene responseVIT_06s0004g01610.t0112.86 1.82 3.69 EIN3; ethylene-insensitive protein 3Ethylene responseVIT_04s0008g05470.t0143.08 18.51 29.03 EBF1_2; EIN3-binding F-box proteinEthylene responseVIT_11s0016g05410.t0195.63 23.29 56.88 EBF1_2; EIN3-binding F-box proteinEthylene responseVIT_05s0049g00510.t0114.34 912.40 2785.17 ERF1; ethylene-responsive transcription factor 1Ethylene responseVIT_07s0005g03230.t0183.64 1.15 0.60 ERF1; ethylene-responsive transcription factor 1Ethylene responseVIT_07s0005g03260.t0146.62 0.59 0.24 ERF1; ethylene-responsive transcription factor 1Ethylene responseVIT_14s0081g00730.t016.63 0.12 0.03 ERF1; ethylene-responsive transcription factor 1Ethylene response
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1植物材料 2
1.1.2 化学试剂2
1.2方法 3
1.2.1总RNA提取、纯化及cDNA文库构建3
1.2.2转录组测序分析3
1.2.2.1数据过滤 3
1.2.2.2测序饱和度、测序覆盖度及测序覆盖深度分析4
1.2.2.3差异表达基因的筛选 4
1.2..2.4 差异基因GO、Pathway显著性富集分析 4
1.2.3 qRTPCR分析基因表达 4
2结果与分析5
2.1测序质量评估5
2.1.1 Reads整体质量评估5
2.1.2差异表达基因的筛选5
2.1.3 GO功能显著性分析6
2.1.4Pathway显著性富集分析7
2.2乙烯代谢相关基因在‘藤稔’果实发育过程中的研究7
2.3 qRTPCR验证基因表达8
3讨论 9
致谢11
参考文献12
附录1 13
葡萄果实乙烯号转导途径的初步研究
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
p 957, down is 4,663 points. DAF90 difference compared with the total number of genes as the fruit DAF40 5,196, which raised 1,340, down 3,856 points. DAF90 fruit and DAF65 difference compared to 3,381 the total number of genes, including a 2,035 increase, a reduction is 1,346. Genes differentially expressed GO analysis and Pathway analysis found that fruit development ethylene signal transduction pathway associated differentially expressed genes in the growth cycle of grapes first high expression level, while the lowest expression of veraison, the results can be grape future growth and development regulation ethylene theoretical reference.KEYWORDS: grape; development; gene; different expression; ethylene引言：葡萄果实在授粉受精后开始发育，经过细胞分裂和膨大，最终形成种子并成熟的动态过程[1]果实的成熟过程经历了一系列特殊的生理生化变化过程，涉及细胞壁的修饰、淀粉向糖的转化、色素的合成、芳香物质的积累和多酚类物质及抗氧化系统的变化等[2]，这些过程不仅受到如基因表达、生长发育阶段等因素的调控，还受到内源激素的调控。葡萄作为一种常见的果实可直接工人使用也可用作葡萄干葡萄酒等的原料具有较高的经济价值，其果实发育和成熟过程的研究就显得尤为重要。葡萄浆果的生长表现为双S型曲线，分为3个生长阶段：第一生长周期、停滞期和第二生长周期。在第一生长周期，浆果中大多数的化合物、矿物质、氨基酸、微量元素等都随着浆果体积的增大而积累，并在转色期达到表观最大值。停滞期也叫硬核期，这一时期整个浆果的生长速度明显减缓。这一时期葡萄浆果纵横径基本不增大，主要进行种胚的发育和种皮的硬化，浆果酸度达最高水平，并开始了糖的积累。此期结束的标志是浆果开始退绿变软，因此这个转折点也叫转色期（veraison），这是浆果发育进入第二生长周期、浆果成熟期的信号。在转色期中葡萄浆果的风味形成主要决定于糖酸比的平衡、风味物质和芳香族化合物的合成或一些前体的形成。葡萄浆果在停滞期发生的这一系列特征变化在很大程度上决定了浆果成熟时的品质[3]。随着葡萄浆果颜色的变化和硬度的降低，浆果再次生长，进入第二生长周期。浆果中的含糖量急剧上升，含酸量迅速下降，其中主要是苹果酸的减少。单宁的含量也有了显著的降低。虽然在浆果的第一生长周期化合物发生了重要变化，但更重要的是化合物含量在第二生长周期发生了重大的提高（主要是葡萄糖和果糖），使得果实从总生化反应转入果实成熟模式。尽管关于葡萄果实重要三个生长时期的生理与生化研究较为清楚，但基因水平上到底有多少乙烯信号转导途径相关基因及生物网络直接或间接参与仍需进一步研究。葡萄基因组测序的完成[4]为葡萄基因组的认识提供了研究手段与重要信息。新一代Illumina高通量测序技术（RNA-Seq技术），能从单核苷酸对特定物种的整体转录活动进行检测[5][6]，从而快速全面获得该物种在某一特定状态下几乎所有转录本的信息[7]。不同于传统的芯片、SSR等差异显示技术，基于RNA-Seq技术的数字基因表达谱在mRNA差异筛选方而显示出强大的优势，它无需对数据集进行复杂的标准化便可以提供不同样品间基因差异表达的“数字化测量”[8][9][10]。由于转求组测序可以得到RNA转录本的丰度信息，使其具有十分广泛的应用前景[11] [12]。基于RNA-Seq获得的序列和表达量信息有助于构建动态的基因变化网络，为相关机制的探明提供线索。近年来，虽然RNA-Seq技术已被应用到葡萄上[13]，但还需要更详细的研究去了解浆果发育过程中复杂的基因表达变化。在本文中，我们利用转录组测序技术从全基因组水平揭示‘藤稔’葡萄在第一生长周期（花后40天）、转色期（花后65天）和成熟期（花后90天）中果实生长发育乙烯相关基因的表达与调控的分子机制并利用对葡萄转录组中重要差异表达基因进行qRT-PCR验证。1材料与方法1.1 材料1.1.1植物材料‘藤稔’葡萄（Vitis labruscana cv. ‘Fujiminori’）果实均采自于大学江浦实验基地。采样的时间为花后40d、65d和90d。所有样品采集后立即在液氮中速冻并贮于-70 ℃冰箱中备用。1.1.2 化学试剂大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α由本实验室保存；pMD19-T simple载体购自TaKaRa公司。DEPC为Ameresco产品；水饱和酚、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）为BASF产品；β-硫基乙醇、SDS为Sigma产品；荧光定量染料SYBR? Green I、dNTP（10mM）、Ex-Taq酶、RNA酶抑制剂和RNase Free DNaseⅠ购自日本TaKaRa公司；Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）购自Ambion公司（Ambion, Austin, TX）；Axygen DNA回收试剂盒、DL 2000 Plus DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；常规化学药品及试剂购自Sigma公司或为国产AR级试剂。cDNA合成、由上海捷瑞生物技术有限公司合成，定量引物由北京鼎国生物技术有限公司合成，其编号及序列见表1-1。表1-1引物序列序列IDSeq ID引物（3‘-5’）Primer （3‘-5’）引物（5‘-3’）Primer R（5‘-3’）VIT_02s0025g00360.t01GCTCATCCTTCCATTGCTCGTGGCAGACACCTCCTTTTCTVIT_11s0016g02380.t01TCTTGGTTTGGAGAAGGGCTCCCTAACAAGCTCAGGTCGAVIT_05s0049g00090.t01GTTGTTCTGAGAGGTGGGGACACACCGGATTCCAAACCAGVIT_08s0040g01730.t01AGATTTCTGGAAGCAGCCCTGACCCAACCCAGCTAGTCTTVIT_06s0004g01610.t01GGAGGATGGCAGAATTCACGCCACAGGTCTATCTTGCCCAVIT_11s0016g05410.t01CCTGCCGGGGTATAACAGATATTGCAGGCCCTCAAGAGATVIT_17s0000g02230.t01CGTCCCTTTGCATCATCTGGVGGCTTCCCACTTGCTTTTCAVIT_02s0012g01320.t01GGTGGTGGTGGAGATTCTGATTTGCAGGTTTTCTCCCACGVIT_01s0010g02750.t01CAAAGATCTCCGGCGTGAAGGATCCTCGCTCTTGTCAGGAVIT_03s0063g01820.t01GTCCTCCTCGACTCCATCAGTCGGAAGGGTCGAGATATGCVIT_14s0083g00110.t01CTTCCTCGTTCAAGCTGCTCGTGAGGTTGTGGGATGGAGAVIT_10s0042g01250.t01GTGCTGTTAGTATCTGCCGCTTGACACATCTCCAGCCAGTVIT_11s0016g01990.t01GGCGGTTTTGGGGTATTTGTAGAGCACCTCCACCATGAAAVIT_08s0007g06160.t01AAACGCCAGACCCTAAGACAGTGTGAGCTTGATCCTGCTGVIT_07s0031g01320.t01CAGATTAGCACGTGGGGAGATCAGAAGGTCCAGGTGTTCCVIT_03s0088g00700.t01AGTTGGCGTTGGGTCTATGACTGTCAATGAACCACTGCCCVIT_08s0040g01710.t01GGATCAACACCCTCCTCCAAAGAGGCAAGCTTGGAGTGATVIT_07s0031g01850.t01TGCTTCAGAACTGGGAGGAGATCGAAGCTCCGCATTCAACVIT_18s0001g10690.t01CCTCCACCACAATCCCAGATGTGGAGGAGCGAGGAGATACVIT_02s0025g03550.t01ATTGCGGGTTCTCTGTGGTAACAATACCCTCAACACCGGTVIT_14s0083g01110.t01CTCCATGACCACCCAAGAGTTCAAAGATCACAGCTCGGGTVIT_19s0085g00830.t01GTTGGTCTGGGCTTTGAAGGATTCACACACTCCGGGAAGTVIT_18s0001g11320.t01TGTTCGGTATGCGCATGAAGTTCAGGCTTCCACTCCTCAGVIT_19s0140g00140.t01GGAGAACACACAGACCCTCAAGAAGGAGTTGGCATCAGGTVIT_01s0011g05260.t01GGACAACACCGATCATCTGCCGTCGAGATCTGCCAAACTGVIT_16s0050g02620.t01TGATGGTTGTTGTTGCCGTTCCGAATGTACTCCGACTCCAVIT_13s0175g00120.t01GGAGTTGTCGCTGAACCATCCGGAAATTGTGGTTGTGGGTVIT_07s0031g00620.t01TAGTTCAGTGCAGCCTTCGACACCCTCTTCTTTTGCCCACVIT_19s0093g00550.t01AAACTGCTCTCTCCACTCCCATTGCGGTGAGACAGAGGAAVIT_07s0104g00270.t01GTGGAGAAGGGAATGGTGGATCTTCGTCCAGGAAACCCTCVIT_04s0008g01880.t01GACGAGGTTTGTGGAGAGGACCATCCATCCATCGTCCTCAVIT_05s0020g02210.t01ATGGAGGTGGTTCAGATGCACAGGGTTGCTCTCATCTTGCVIT_01s0011g05830.t01TCGGTGTCATCTTGCTCAGTAGAGCCCTGGATATCGCAAAVIT_17s0000g07580.t01CTGACTCGCATTGACAGGTGCCTCTCCCTCTTCCTCTCCTVIT_13s0067g00330.t01TGGACAAGAGGACATGGACCCAGGGCTGCAATGGTCAAATVIT_09s0002g05150.t01AACCCTAGCTCTACCTCCCACCAGCAAGGTGGTTTGAGTCVIT_01s0244g00150.t01GTTGAGGAGGCATGCTGATGATCGCCACTCATTTCCATGCVIT_18s0001g02610.t01GAGATTGTACGGCGTTGGACCAAGTGGTACCAGCTCTCCAVIT_07s0104g01250.t01AGCATCAGAGGCAGTGAAGTCATGAGCCTTGCAAACCCATVIT_17s0000g08990.t01GAGATCCAGCGTCGTGAAACAGAGACAGACGTTGAAGGCA1.2 方法 1.2.1总RNA提取、纯化及cDNA文库构建从样本中提取总RNA，使用2100 Bioanalyzer对总RNA进行质检。利用DNaseI （TaKaRa，日本）对合格RNA进行37℃消化30 min。DNase消化后的RNA利用Dynabeads? Oligo （dT）25（Life，美国）进行mRNA纯化。用NEBNext? UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，美国）构建cDNA文库。1.2.2转录组测序分析转录组测序工作由上海翰宇生物科技有限公司完成。取10 ng的文库，用TruSeq PE Cluster Kit（illumina，美国）在cBot中进行cluster generation，然后在Illumina HiseqTM2500中进行双向测序。1.2.2.1数据过滤为保证信息分析质量，必须对原始数据中含有带接头的、低质量的reads过滤，得到clean reads。使用的软件为FASTX-Toolki（http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/）。数据处理的步骤：1) 使用fastx_clipper去除reads中的接头序列；2) 使用fastq_quality_filter从read 3’到5’方向开始去除N（N表示无法确定碱基信息）至第一个不是N的碱基；3) 使用fastq_quality_filter从read 3’到5’方向开始去除连续出现的低质量碱基，当去除低质量的clean reads长度低于40bp时删除read本身及其配对的序列；4) 使用本地脚本配对pair end reads（PE测序使用）。1.2.2.2测序饱和度、测序覆盖度及测序覆盖深度分析 测序饱和度分析是用来衡量一个样品的测序量多少的标准，随着测序量（reads数量）的增多，检测到的基因数也随之上升，当测序量达到某个值时，其检测到的基因数增长速度趋于平缓，说明检测到的基因数趋于饱和。基因覆盖度指每个基因被reads覆盖的百分比，其值等于基因中unique mapping reads覆盖的碱基数跟基因所有碱基数的比值。1.2.2.3差异表达基因的筛选将测序序列mapping到预测基因上，统计每个基因中分别来自2个样品的reads数目，并转换成RPKM[8]，利用DEGseq程序包中的MARS （MA-plot-based method with Random sampling model）模型[11]，计算每个基因在2个样品中的表达丰度差异，FDR值小于0.001且倍数差异不低于2倍的基因的即被认定为具有显著性差异。1.2.2.4 差异基因GO、Pathway显著性富集分析GO功能显著性富集分析首先把所有差异表达基因向Gene Ontology数据库（http://www.geneontology.org/）的各term映射，计算每个term的基因数目，然后再利用超几何分布统计计算出对每一个代谢通路和GO类别具有显著性表达差异的基因相对全部基因的显著富集情况。在生物体内，不同基因相互协调行使其生物学功能，基于Pathway的分析有助于更进一步了解基因的生物学功能。KEGG是有关pathway的主要公共数据库[14]。Pathway显著性富集分析以KEGG Pathway为单位，应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在差异表达基因中显著性富集的Pathway。1.2.3 qRT-PCR分析基因表达通过qRT-PCR技术对‘藤稔’葡萄果实发育过程中差异表达候选基因进行的表达情况进行验证。分别取2μgRNA以P01和P02引物反转录合成cDNA，以葡萄Actin基因（NCBI登录号：AF369524）为内参进行定量PCR，目的基因的引物及片段大小见表1-2。各种引物由北京鼎国生物技术有限公司合成。表1-2 引物序列及用途编号Code No序列Sequence (5-3)用途UseP01GCAGGACTGCAGCTGACTGACTACT30VNcDNA合成P02GACCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGcDNA synthesisVvACO1-1302-1GAAGATCTTCATGAAGGAATTCACCGCGCApCAMBIA-1302VvACO1-1302-2GGACTAGTCCAACTGTGGCAATGGGACCVvERF-1302-1GAAGATCTTCATGGATTCTTCTTCCTTCTATCATCpCAMBIA-1302VvERF -1302-2GGACTAGTCCTGATGAACACAAGAGTTGCTCCPpACO1-1302-1ATCATGCCATGGCATGGGAGAACTTCCCAATCATCAACpCAMBIA-1302PpACO1-1302-2GGACTAGTCCAGCTGTTGCAATTGGACCCAAPpEIN3-1302-1GAAGATCTTCATGGGTTTCTGTGGTAATCTTGATpCAMBIA-1302PpEIN3-1302-2GGACTAGTCCGATCCAAAATGCATCTTGCTTCVvACO1-TRV-1CGCGGATCCGCGATGAAGGAATTCACCGCGCApTRV2VvACO1-TRV-2CCGCTCGAGCGGTCAAACTGTGGCAATGGGACCVvERF-TRV-1CGGGATCCCGATGGATTCTTCTTCCTTCTATCATCpTRV2VvERF- TRV-2CCGCTCGAGCGGTGATGAACACAAGAGTTGCTCCPpACO1-TRV-1CGGGATCCCGATGGAGAACTTCCCAATCATCAACpTRV2PpACO1- TRV-2GCTCTAGAGCAGCTGTTGCAATTGGACCCAAPpEIN3-TRV-1CGGGATCCCGATGGGTTTCTGTGGTAATCTTGATpTRV2PpEIN3- TRV-2GCTCTAGAGCGATCCAAAATGCATCTTGCTTCActin-1CCCCATGCTATCCTTCGActin 扩增Actin-2AGGCAGCTCATAGTTCTTCTCActin amplificationVvACO1-1TGTCATCAACCTAGGTGATCAGC半定量RT-PCRVvACO1-2GCTTCATGTAGTCCTCAAACACGSemi-Quantitative RT-PCRVvERF-1GTATAGGGGTGTCAGGAAGCG半定量RT-PCRVvERF-1CAGGCGTACTTGATGTCCCTTSemi-Quantitative RT-PCRPpACO1-1TGCGCCATCTTCCAAAATCTA半定量RT-PCRPpACO1-2GGTACCCTTGTTCAAGTCCAASemi-Quantitative RT-PCRPpEIN3-1ACAATCAGCGGTACCAGTGA半定量RT-PCRPpEIN3-2GCATCATCTGTGGCTCTTCGSemi-Quantitative RT-PCRTRV1-1TTACAGGTATTTGGGCTAGTRV1扩增TRV1-2CCGGGTTCAATTCCTTATCTRV1 amplificationTRV2-1TTACGACGAACCAAGGGAGTACTACTRV2扩增TRV2-2AGCACAATTAGCCCTATTTAGATGTTRV2 amplificationLeACO1-1AGGAGGCATCATACTTCTGTTC定量RT-PCRLeACO1-2ACAATAGAGTGGCGCATGGGAQuantitative RT-PCRLeERF-1TGCTCTATGACCTTCTCGCA定量RT-PCRLeERF-2ATCTCTAATCTCCGCCGCAAQuantitative RT-PCRLeEIN3-1TTTCAGCCCGATAAACAGCG定量RT-PCRLeEIN3-2CTTAGCCTGTGACTCCTCGTQuantitative RT-PCR利用ABI PRISM 7500 real-time PCR system（Applied Biosystems, USA）荧光定量PCR仪进行实时荧光定量RCR分析。反应体系按SYBR? Green I（TaKaRa）说明书进行，其优化后的反应条件为：95℃预变性60 s，95℃ 15 s、59.6℃ 15 s，72℃ 20 s、40个循环，试验设置3次重复。利用7500 System software version 2.0.5软件对扩增曲线和溶解曲线进行分析，验证引物的特异性及扩增条件，确定合适的阈值和Ct值，利用2－ΔΔCt方法相对定量各基因与内参Actin表达量的差异。2 结果与分析2.1测序质量评估2.1.1 Reads整体质量评估从表2-1的Read分布可知，所测序分析的样本，最终得到的Clean Read的数量都占总测序的96%以上，仅少数是只有接头序列或包含未知碱基序列的Reads。与参考基因的比对数达到64%以上，利于数据分析。表2-1 葡萄三个时期样品与参考基因比对统计结果Map to GeneDAF40DAF65DAF90Raw Reads298599352824148726473446Clean Reads28808716 (96.48%)27841132 (98.94%)25457565 (96.22%)rawdata5.69G5.97G5.65Gcleandata5.63G5.76G5.59GTotal mapped(percent of clean reads)18543240 (64.37%)21785051 (77.97%)20675429 (81.22%)Unique_match(percent of clean reads)16171753 (56.13%)18888870 (67.60%)17462185 (68.59%)Mutliple_match(percent of clean reads)2371487 (8.23%)2896181 (10.37%)3213244 (12.62%)Total unmapped(percent of clean reads)10265476 (35.63%)6156081 (22.03%)4782136 (18.78%)2.1.2差异表达基因的筛选所有clean reads经过参考基因库进行注释之后，对不同样品的基因进行比对，筛选差异基因。设定FDR≤0.001和|log2Ratio|≥1作为阈值来判断基因是否在两个样品中差异表达。通过对比分析选出大量在‘藤稔’果实发育过程中差异表达的基因（图2-1）。其中，DAF65与DAF40果实相比差异表达基因数目为5620个，上调957个，下调的是4663个。DAF90与DAF40果实相比差异基因总数为5196，其中上调1340个，下调3856个。DAF90与DAF65果实相比差异基因总数为3381个，其中上调2035个，下调的是1346个。图2-1 ‘藤稔’不同发育时期果实差异表达基因的统计2.1.3 GO功能显著性分析GO基因功能分类体系可分为基因的分子功能（molecular function）、参与的生物过程（biological process）、构成的细胞组成（cellular component）。基于序列同源性，对DAF65与DAF40的5620个差异基因进行GO富集分析，共有2584个转录本注释到GO途径，且分为49个功能组；对DAF90与DAF40的5196个差异基因进行GO富集分析，共有2474个转录本注释到GO途径，且分为49个功能组；对DAF90与DAF65的3381个差异基因进行GO富集分析，共有1623个转录本注释到GO途径，且分为50个功能组。由图4-2可知，1）参与的分子功能中：分子结合（binding）和催化活性（catalytic activity） 两个分类数量最多；2）参与生物过程中：代谢过程（metabolic process）和细胞生理过程（cellular process）两个分类数量最多；3）构成细胞组分的9个种类中：细胞（cell）和细胞部分（cell part）两个分类数量最多（图2-2）。图2-2葡萄三个不同发育时间浆果差异表达基因的Go Ontology分类2.1.4Pathway显著性富集分析KEGG数据库能够系统分析基因产物所参与的代谢途径及其功能。我们对三个样品的差异表达基因进行Pathway富集，最后将DAF90/DAF65和DAF65/DAF40的差异基因其归入32个KEGG途径，将DAF90/DAF40的差异基因归入31个KEGG途径（图4-3）。包括糖代谢、翻译、氨基酸代谢、信号转导、脂代谢、能量代谢、环境适应、次生代谢产物的生物合成等主要代谢途径。其中包含差异基因最多的三个途径是糖代谢途径、信号转导和氨基酸代谢途径 （图2-3）。图2-3 差异表达基因的Pathway富集分析2.2 乙烯代谢相关基因在‘藤稔’果实发育过程中的研究乙烯对果实发育和成熟具有重要作用，能够增加浆果直径、加速果实成熟、促进花青素生物合成基因的表达和积累。抑制乙烯能够延缓果实成熟。大量研究表明，乙烯的生物学效应是通过乙烯信号转导途径得以实现的 [15][16]。在此研究中，我们以RPKM（Reads Per Kilobase of exon per Million）值的大小对果实转录表达水平进行评估[8]。在DAF40、DAF65、DAF90三个时期的葡萄果实中共鉴定出21个差异表达基因响应乙烯生物合成及信号转导途径（附表1）。其中乙烯生物合成途径中鉴定到3个SAMS差异表达基因（VIT_08s0007g05000.t01、VIT_07s0005g02230.t01、VIT_14s0060g00480.t01）、1个ACS差异表达基因（VIT_02s0025g00360.t01）和3个ACO差异表达基因（VIT_12s0059g01380.t01、VIT_11s0016g02380.t01、VIT_00s2086g00010.t01）。在信号转导途径中分别鉴定到4个乙烯受体（VIT_07s0005g00850.t01、VIT_05s0049g00090.t01、VIT_14s0081g00630.t01、VIT_06s0004g05240.t01）和ERF（VIT_05s0049g00510.t01、VIT_07s0005g03230.t01、VIT_07s0005g03260.t01、VIT_14s0081g00730.t01），2个EBF1/2（VIT_04s0008g05470.t01、VIT_11s0016g05410.t01），1个CTR1（VIT_08s0007g03910.t01）、MPK6（VIT_13s0074g00430.t01）、EIN2（VIT_08s0040g01730.t01）和EIN3（VIT_06s0004g01610.t01）差异表达基因。图2-4 果实发育不同时期乙烯生物合成及信号转导途径相关基因转录水平变化SAM：腺苷蛋氨酸合成酶；ACS：1- 氨基环丙烷- 1- 羧酸合成酶；ACO：1- 氨基环丙烷- 1- 羧酸氧化酶；ETR：乙烯受体；CTR1：乙烯三重反应元件；MPK6：蛋白激酶；EIN2：乙烯不敏感蛋白2；EIN3：乙烯不敏感蛋白3；EBF1/2：结合EIN3的F-box蛋白；ERF：乙烯反应元件；基因柱形图下方的数字表示在果实不同发育时期差异表达的基因数目从整个乙烯合成和信号转导网络途径来看（图2-4），大部分基因在第一生长周期（DAF40）表达水平最高，随后在转色期（DAF65）降低，而在成熟期（DAF90）各基因的表达水平又再次上升。但其中一个ACO基因（VIT_11s0016g02380.t01）的表达情况与此相反，在转色期表达水平最高，在第一生长周期表达水平最低。鉴定到的4个ERF基因中也有一个基因（VIT_05s0049g00510.t01）在第一生长周期表达水平最低。这说明同一基因家族不同成员在果实生长发育过程中调控作用不同，而葡萄果实乙烯相关基因转录水平在转色期的下降可能意味着葡萄在果实发育的早期对乙烯更敏感。2.3 qRT-PCR验证基因表达为了验证葡萄转录组测序数据的准确性和重复性，随机挑选了40个差异表达基因利用qRT-PCR技术对转录组数据进行验证。40个基因涉及8种不同激素的合成和信号转导途径。将qRT-PCR与转录组数据对比结果表明，只有VIT_05s0020g02210.t01、VIT_13s0175g00120.t01、VIT_08s0040g01710.t01和VIT_11s0016g05410.t01四个基因表达模式与转录组数据有差异，其余36个基因表达模式与转录组数据数据一致，准确率达90%，表明转录组数据具有较高的准确性（图2-5,表1-1）。图2-5 qRT-PCR验证转录组差异表达基因数据3 讨论RNA-Seq技术能够准确确定RNA的表达水平，并对实验结果直接进行比较。RNA-Seq可以捕捉组织不同状态下的转录组动态变化，并不需要对对数据集进行复杂的标准化[17][18][8]。在本研究中，利用RNA-Seq技术获得‘藤稔’葡萄不同发育时期果实的表达谱，发掘并分析了乙烯相关基因的表达情况。这为研究葡萄果实发育过程中激素的动态变化提供了依据。果实成熟是一个高度协调、基因程控和不可逆转的生物学过程，包含生理、生化和影响感官等一系列的变化，以形成可食用的成熟果实。植物激素（plant hormones）是植物体内合成的对植物生长发育有显著作用的几类微量有机物质，也被称为植物内源激素。植物激素是在低浓度时可调节植物生理反应的活性物质，由植物细胞接受特定环境信号诱导产生，在植物的生长过程中扮演极其重要的角色。它们在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发以及离体组织培养等方面，分别或相互协调地进行着调控。本研究对差异表达的基因进行GO分析和Pathway分析，发现葡萄果实发育中乙烯信号转导途径相关的差异表达基因所占比例，进一步对乙烯合成及信号转导网络分析，发现与乙烯代谢相关的基因在葡萄果实第一生长周期表达量较高，而在转色期表达量最低。这说明大量乙烯合成及信号转导相关基因参与到果实生长发育的过程中，而这些基因在葡萄生长发育过程中大都是时空特异性表达，它们可能参与特定发育时期的生理生化过程。藤稔’葡萄果实成熟过程中乙烯相关基因的分析。每个发育时期的样本，能够比对到参考序列上的总reads条数都在64%以上。DAF65与DAF40果实相比差异表达基因数目为5,620，上调957个，下调的是4,663个。DAF90与DAF40果实相比差异基因总数为5,196，其中上调1,340个，下调3,856个。DAF90与DAF65果实相比差异基因总数为3,381个，其中上调2,035个，下调的是1,346个。对差异表达的基因进行GO分析和Pathway分析，发现葡萄果实发育涉及到乙烯相关基因中信号转导途径中相关基因的表达差异，发现乙烯代谢的基因在葡萄果实第一生长周期表达量较高，而在转色期表达量最低。致谢首先感谢导师贾海峰不仅在实验研究中帮助我很多，而且也是我的心灵导师。还有我的师兄赵鹏程，帮助我解答实验中不太懂的知识且帮助我修改了论文。最后感谢我的父母养育我理解我。参考文献[1]Vvedenskaya IO, Vorsa N. 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Defining transcribed regions using RNA-seq [J]. Nature Protocols, 2010, 5: 255-266[7]Nagalakshmi U, Wang Z, Waem K et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing [J]. Science, 2008 ,320: 1344-1349[8]Mortazavi A, Williams BA, McCue K, et al. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq [J]. Nature Methods, 2008, 5: 621-628[9]Cloonan N, Forrest AR, Kolle G, et al. Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNAsequencing [J], Nature Methods, 2008, 5: 613-619 [10]Haas BJ, Zody MC. Advancing RNA-Seq analysis [J]. Nature Biotechnology, 2010, 28: 421-423[11]Wang L, Feng Z, Wang X et al. DEGseq: an R package for identifying differentially expressed genes from RNA-seq data [J]. Bioinformatics, 2010, 26: 136-138[12]Kim KH, Kang YJ, Kim DH, et al. RNA-Seq Analysis of a Soybean Near-Isogenic Line Carrying Bacterial Leaf Pustule-Resistant and-Susceptible Alleles [J]. DNA Research, 2011, 18: 483-497[13]Zenoni S, Ferrarini A, Giacomelli E, et al. Characterization of transcriptional complexity during berrydevelopment in Vitis vinifera using RNA-Seq [J]. Plant Physiology, 2010, 152: 1787-1795[14]Kanehisa, M, Araki M, Goto S, et al. KEGG for linking genomes to life and the environment [J]. Nucleic Acids Research, 2008, 36: D480-D484[15]Chen YF, Etheridge N, Schaller GE. Ethylene signal transduction [J]. Annals of Botany, 2005, 95: 901-915[16]安丰英, 郭红卫. 乙烯信号转导的分子机制. 植物学通报, 2006, 23(5): 531-542.[17]Wilhelm BT, Marguerat S, Watt S, et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution [J]. Nature, 2008, 453: 1239-1243[18]Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics [J]. Nature Reviews Genetics, 2009, 10: 57-63 附表1表 1葡萄果实生长发育过程中差异表达的乙烯相关基因RefSeq 序列RefSeq Accession花后40天DAF40花后65天DAF65花后90天DAF90注释Annotaion功能FunctionVIT_08s0007g05000.t0146.07 26.44 176.85 metK; S-adenosylmethionine synthetase Ethylene biosynthesisVIT_07s0005g02230.t0194.43 39.00 26.14 metK; S-adenosylmethionine synthetase Ethylene biosynthesisVIT_14s0060g00480.t011029.61 337.67 220.91 metK; S-adenosylmethionine synthetase Ethylene biosynthesisVIT_02s0025g00360.t0150.64 3.00 6.18 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthaseEthylene biosynthesisVIT_12s0059g01380.t01201.61 45.13 99.65 aminocyclopropanecarboxylate oxidase Ethylene biosynthesisVIT_11s0016g02380.t012.57 284.82 68.04 aminocyclopropanecarboxylate oxidase Ethylene biosynthesisVIT_00s2086g00010.t01343.20 13.32 19.40 aminocyclopropanecarboxylate oxidase Ethylene biosynthesisVIT_07s0005g00850.t0146.92 7.52 19.32 ETR, ERS; ethylene receptor Ethylene responseVIT_05s0049g00090.t01109.48 29.39 39.75 ETR, ERS; ethylene receptor Ethylene responseVIT_14s0081g00630.t0116.21 5.05 11.75 ETR, ERS; ethylene receptor Ethylene responseVIT_06s0004g05240.t0118.50 0.01 0.70 ETR, ERS; ethylene receptor Ethylene responseVIT_08s0007g03910.t0110.66 3.68 7.67 CTR1; serine/threonine-protein kinase CTR1 Ethylene responseVIT_13s0074g00430.t0111.11 3.64 5.20 protein kinase domain containing protein, expressedEthylene responseVIT_08s0040g01730.t0122.02 10.53 27.43 EIN2; ethylene-insensitive protein 2Ethylene responseVIT_06s0004g01610.t0112.86 1.82 3.69 EIN3; ethylene-insensitive protein 3Ethylene responseVIT_04s0008g05470.t0143.08 18.51 29.03 EBF1_2; EIN3-binding F-box proteinEthylene responseVIT_11s0016g05410.t0195.63 23.29 56.88 EBF1_2; EIN3-binding F-box proteinEthylene responseVIT_05s0049g00510.t0114.34 912.40 2785.17 ERF1; ethylene-responsive transcription factor 1Ethylene responseVIT_07s0005g03230.t0183.64 1.15 0.60 ERF1; ethylene-responsive transcription factor 1Ethylene responseVIT_07s0005g03260.t0146.62 0.59 0.24 ERF1; ethylene-responsive transcription factor 1Ethylene responseVIT_14s0081g00730.t016.63 0.12 0.03 ERF1; ethylene-responsive transcription factor 1Ethylene response
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1植物材料 2
1.1.2 化学试剂2
1.2方法 3
1.2.1总RNA提取、纯化及cDNA文库构建3
1.2.2转录组测序分析3
1.2.2.1数据过滤 3
1.2.2.2测序饱和度、测序覆盖度及测序覆盖深度分析4
1.2.2.3差异表达基因的筛选 4
1.2..2.4 差异基因GO、Pathway显著性富集分析 4
1.2.3 qRTPCR分析基因表达 4
2结果与分析5
2.1测序质量评估5
2.1.1 Reads整体质量评估5
2.1.2差异表达基因的筛选5
2.1.3 GO功能显著性分析6
2.1.4Pathway显著性富集分析7
2.2乙烯代谢相关基因在‘藤稔’果实发育过程中的研究7
2.3 qRTPCR验证基因表达8
3讨论 9
致谢11
参考文献12
附录1 13
葡萄果实乙烯号转导途径的初步研究
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