荷花sbp基因家族分析与克隆鉴定
摘要： 1摘要: 基因家族是由同一个祖先基因发展而来的，基因通过反复的重复而形成的一组基因。基因家族成员在序列和功能上具有一定的相似性。SBP-BOX基因家族是只在植物中存在的转录因子基因家族，是植物所特有的。荷花是观赏性的植物，所以研究SBP基因在荷花中的表达模式是很有价值的。本研究中，利用已知基因所编码的SBP蛋白的结构域作为检索序列，在相关数据库中检索。根据系统发生树将基因家族分成了若干个亚组，每一亚组在基因结构，基序排布上均具有较高的相似性。同义替换率和非同义替换率与的分析表明同源基因的结构域受到纯化选择的作用。结构域之外的区域受到正选择或较弱的纯化选择作用。 我们进一步克隆了其中一个关键的SBP基因，并构建过表达载体。本研究为将来进一步系统研究荷花SBP基因家族奠定基础。
目录
引言
引言：转录因子(Transcription factor, TF)是一种DNA结合蛋白质，其能够在mRNA转录水平上调控相应基因的表达。[4,5]SBPbox基因家族属于的TF基因家族，是植物所特有的，属于锌指蛋白转录因子，该转录因子能够起到激活或者抑制多个目标基因的表达的作用。SBPbox基因的发现首先来源于金鱼草(Antirrhinum majus)，该基因所编码的蛋白质产物可以起到结合在花的分生组织上面识别基因SQUAMOSA的启动子区段的作用。[6]之后，SBPbox基因在越来越多的植物中被相继发现，[710]引发了众多研究人员对该基因的作用及功能进行了大量的相关研究。Birkenbihl[11]领域专家又在模式植物拟南芥中发现了SBPbox基因116，并将它们命名SPL1SPL16。在花的分生组织、花的叶子、花芽和顶端中SPL3基因可以高度表达。[8]在受到长时间日照的开花诱导情况下SPL3、4、5会高度表达。SPL8能够调控花粉的发育。[12]该SBP基因家族中序列最长的基因之一是SPL14，同时该基因在近段时间被认为是可能与受到真菌毒素PB1诱导程序性死亡的抗性相关。[13]玉米中也发现了两个SOBbox基因，一个为LIGULELESSI，另一个基因是TGAI。Becraft等[7]人发现如果LIGULELESSI出于被干涉的情况下，会导致玉米的叶耳以及叶舌不能形成。Wang等[14]人发现玉米的花序结构受到TGAI基因
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的编码序列和启动子中几个氨基酸的相关改变的影响，也随之发生变化。SBPbox基因编码的蛋白质中包含一个DNA结合结构域，该结构域高度保守，同时拥有大概是79个氨基酸残基长度，即SBP结构域。研究表明这个结构域的结构特点既有高度保守的双向核定位型号，也有两个锌指结构。该基因在植物中广泛存在，并且对植物生长以及在花的发育过程中中发挥了极其重要的作用。因此，进一步地深入研究该基因家族，不仅对阐明相关高等植物生长发育的调控过程十分有帮助，同时也从另一方面揭示不同的物种间进化是具有很大关联性。
荷花是重要的观赏花卉之一。相比较拟南芥和玉米而言，对于荷花中该基因家族的研究鲜有报道，而且相关研究有很大的滞后性。荷花基因组草图于2013年前后被测序完成。次年，NCBI上公布了荷花的基因组序列。荷花基因组的测序完成，为我们在基因组水平上鉴定未知基因，弥补了学术上的空白，同时也探究这些基因的功能并为进一步针对发育和进化生物学展开研究提供了新的平台。在本研究中，利用生物信息学资源和相关工具，对荷花、拟南芥和水稻中的SBPbox基因家族进行了一定的比较分析。运用多个物种的基因编码的蛋白质序列构建了系统发生树。多对旁系同源基因在系统发生树的末端的节点上被鉴定出来。通过非同义替换率与同义替换率(ka/ks)针对于同源基因分离之后所需要经历的环境选择压力进行了分析。此外我们还搜索了数据库以分析荷花花器官中基因的组织特异性表达。并对表达量丰富的一个NnSBP基因进行克隆与表达载体构建。
1.材料和方法
1.1材料
实验材料为观赏荷花（Nelumbo nucifera Gaertn）品种“红荷”、 氯仿、异戊醇、40 μL β巯基乙醇（25%）、无水乙醇、限制酶、DNA连接酶。
1.2方法
在TAIR数据库中搜索本次实验所需的蛋白质序列，在模式植物拟南芥中取得已知的SBPbox家族基因所编码的蛋白质序列。然后再对这些蛋白质中所包含的SBP结构域进行相关预测，工具为Pfam软件。[15]下一步再使用这些预测出来的SBP结构域区段序列来用作检索序列，使用Blastp来对花基因组注释数据库进行搜索。对检索得到的protein序列进行分析，若得到的protein序列可以符合E≤1010的这个条件，则得到的protein序列将可以被作为候选protein序列。鉴定这些候选的protein序列中是否包含了SBP结构域，则是使用Pfam工具对这些候选的蛋白序列进行检索。若其存在有SBP结构域，那么就可以认为其属于SBPbox 基因家族。新鉴定出来的SBP蛋白质将被作为新的检索序列，来继续检索上述数据库，一直检索到没有新的序列检出，则停止继续检索。获得这些SBPbox Gene Fmily信息之后，分别下载基因组、蛋白质、和CDS序列。
1.2.1序列分析 SBPbox protein多序列联配则采用ClustalX1.83，参数选为默认。系统发生树的构建的方法为Neighborjoining[16]同样的也采用上述CL1.83，并采用bootstrapping分析评估所建立的系统发生树。
1.2.2 Ka和Ks的计算
从系统发生树中推断出荷花、拟南芥和水稻旁系同源的SBPBox基因。旁系同源核苷酸序列的联配是采用蛋白质联配作为向导，利用CLustalX1.83软件进行。手工的去除联配中的空位（gap）。利用Kestimator6.1软件[20]计算旁系同源基因的Ka和Ks值。
1.2.3荷花RNA的提取 CTAB法提取荷花RNA
RNA的抽提
1）取2 ml离心管，加入1 mLRNA抽提缓冲液于65 °C水浴锅中温育30 min以上，使用前在缓冲液中加入40 μL β巯基乙醇（25%），立即取新鲜材料0.1 g加缓冲液于研钵中快速研磨（一般0.1 g新鲜材料/mL缓冲液）。（研钵包在手套里放入水浴锅中一起预热，用时拿出加样品和缓冲液，迅速研磨）。
2）把研磨好的，呈粘稠状的匀浆液移入离心管中，继续在65°C温育10 min。以下操作在超净工作台中进行
3）加入1 mL（等体积）氯仿：异戊醇（24:1）混匀，盖上盖子，上下剧烈摇动15秒，然后于4°C，12000 g，离心10 min。
4）小心吸取上清液至一新的离心管中，重复步骤34， 12次
5）取上清，加入1/4体积的10 M LiCl溶液并混匀，4°C条件下过夜，或20°C条件下放置6小时以上，使RNA沉淀。
6）4°C，12000 g，离心20 min，弃上清，获粗提的总RNA沉淀。
目录
引言
引言：转录因子(Transcription factor, TF)是一种DNA结合蛋白质，其能够在mRNA转录水平上调控相应基因的表达。[4,5]SBPbox基因家族属于的TF基因家族，是植物所特有的，属于锌指蛋白转录因子，该转录因子能够起到激活或者抑制多个目标基因的表达的作用。SBPbox基因的发现首先来源于金鱼草(Antirrhinum majus)，该基因所编码的蛋白质产物可以起到结合在花的分生组织上面识别基因SQUAMOSA的启动子区段的作用。[6]之后，SBPbox基因在越来越多的植物中被相继发现，[710]引发了众多研究人员对该基因的作用及功能进行了大量的相关研究。Birkenbihl[11]领域专家又在模式植物拟南芥中发现了SBPbox基因116，并将它们命名SPL1SPL16。在花的分生组织、花的叶子、花芽和顶端中SPL3基因可以高度表达。[8]在受到长时间日照的开花诱导情况下SPL3、4、5会高度表达。SPL8能够调控花粉的发育。[12]该SBP基因家族中序列最长的基因之一是SPL14，同时该基因在近段时间被认为是可能与受到真菌毒素PB1诱导程序性死亡的抗性相关。[13]玉米中也发现了两个SOBbox基因，一个为LIGULELESSI，另一个基因是TGAI。Becraft等[7]人发现如果LIGULELESSI出于被干涉的情况下，会导致玉米的叶耳以及叶舌不能形成。Wang等[14]人发现玉米的花序结构受到TGAI基因
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
的编码序列和启动子中几个氨基酸的相关改变的影响，也随之发生变化。SBPbox基因编码的蛋白质中包含一个DNA结合结构域，该结构域高度保守，同时拥有大概是79个氨基酸残基长度，即SBP结构域。研究表明这个结构域的结构特点既有高度保守的双向核定位型号，也有两个锌指结构。该基因在植物中广泛存在，并且对植物生长以及在花的发育过程中中发挥了极其重要的作用。因此，进一步地深入研究该基因家族，不仅对阐明相关高等植物生长发育的调控过程十分有帮助，同时也从另一方面揭示不同的物种间进化是具有很大关联性。
荷花是重要的观赏花卉之一。相比较拟南芥和玉米而言，对于荷花中该基因家族的研究鲜有报道，而且相关研究有很大的滞后性。荷花基因组草图于2013年前后被测序完成。次年，NCBI上公布了荷花的基因组序列。荷花基因组的测序完成，为我们在基因组水平上鉴定未知基因，弥补了学术上的空白，同时也探究这些基因的功能并为进一步针对发育和进化生物学展开研究提供了新的平台。在本研究中，利用生物信息学资源和相关工具，对荷花、拟南芥和水稻中的SBPbox基因家族进行了一定的比较分析。运用多个物种的基因编码的蛋白质序列构建了系统发生树。多对旁系同源基因在系统发生树的末端的节点上被鉴定出来。通过非同义替换率与同义替换率(ka/ks)针对于同源基因分离之后所需要经历的环境选择压力进行了分析。此外我们还搜索了数据库以分析荷花花器官中基因的组织特异性表达。并对表达量丰富的一个NnSBP基因进行克隆与表达载体构建。
1.材料和方法
1.1材料
实验材料为观赏荷花（Nelumbo nucifera Gaertn）品种“红荷”、 氯仿、异戊醇、40 μL β巯基乙醇（25%）、无水乙醇、限制酶、DNA连接酶。
1.2方法
在TAIR数据库中搜索本次实验所需的蛋白质序列，在模式植物拟南芥中取得已知的SBPbox家族基因所编码的蛋白质序列。然后再对这些蛋白质中所包含的SBP结构域进行相关预测，工具为Pfam软件。[15]下一步再使用这些预测出来的SBP结构域区段序列来用作检索序列，使用Blastp来对花基因组注释数据库进行搜索。对检索得到的protein序列进行分析，若得到的protein序列可以符合E≤1010的这个条件，则得到的protein序列将可以被作为候选protein序列。鉴定这些候选的protein序列中是否包含了SBP结构域，则是使用Pfam工具对这些候选的蛋白序列进行检索。若其存在有SBP结构域，那么就可以认为其属于SBPbox 基因家族。新鉴定出来的SBP蛋白质将被作为新的检索序列，来继续检索上述数据库，一直检索到没有新的序列检出，则停止继续检索。获得这些SBPbox Gene Fmily信息之后，分别下载基因组、蛋白质、和CDS序列。
1.2.1序列分析 SBPbox protein多序列联配则采用ClustalX1.83，参数选为默认。系统发生树的构建的方法为Neighborjoining[16]同样的也采用上述CL1.83，并采用bootstrapping分析评估所建立的系统发生树。
1.2.2 Ka和Ks的计算
从系统发生树中推断出荷花、拟南芥和水稻旁系同源的SBPBox基因。旁系同源核苷酸序列的联配是采用蛋白质联配作为向导，利用CLustalX1.83软件进行。手工的去除联配中的空位（gap）。利用Kestimator6.1软件[20]计算旁系同源基因的Ka和Ks值。
1.2.3荷花RNA的提取 CTAB法提取荷花RNA
RNA的抽提
1）取2 ml离心管，加入1 mLRNA抽提缓冲液于65 °C水浴锅中温育30 min以上，使用前在缓冲液中加入40 μL β巯基乙醇（25%），立即取新鲜材料0.1 g加缓冲液于研钵中快速研磨（一般0.1 g新鲜材料/mL缓冲液）。（研钵包在手套里放入水浴锅中一起预热，用时拿出加样品和缓冲液，迅速研磨）。
2）把研磨好的，呈粘稠状的匀浆液移入离心管中，继续在65°C温育10 min。以下操作在超净工作台中进行
3）加入1 mL（等体积）氯仿：异戊醇（24:1）混匀，盖上盖子，上下剧烈摇动15秒，然后于4°C，12000 g，离心10 min。
4）小心吸取上清液至一新的离心管中，重复步骤34， 12次
5）取上清，加入1/4体积的10 M LiCl溶液并混匀，4°C条件下过夜，或20°C条件下放置6小时以上，使RNA沉淀。
6）4°C，12000 g，离心20 min，弃上清，获粗提的总RNA沉淀。
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