荷花ho2基因的克隆和功能鉴定
摘要：血红素加氧酶（heme oxygenase, HO, EC 1.14.99.3）可以降解血红素获得胆绿素（BV）、一氧化碳（CO）和亚铁离子（Fe2+）。近年的研究表明，除了在生长和发育中起着重要作用，如参与光敏色素发色团的合成、促进侧根和不定根的发生等，HO还广泛参与植物对外界胁迫的响应。植物中的HO1基因已有部分报道；但HO2基因却很少被鉴定，HO2在植物抗逆中的功能也有待进一步研究。本研究以荷花为材料，克隆得到荷花NnHO2基因。该基因编码了一个包含320个氨基酸残基的分子量为36.15 KDa多肽，其中含有44个氨基酸的转运肽。通过蛋白序列分析，NnHO2含有血红素加氧酶的保守特征序列，并和其他植物中的HO蛋白序列有着高度一致，但是不具有结合血红素（heme）的His位点。为了验证荷花HO2基因的功能，我们进一步构建了荷花HO2基因的过表达载体，并进行了烟草转基因。本工作为未来进一步鉴定NnHO2基因的功能奠定基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 化学试剂与仪器 3
1.2 菌株和质粒载体 3
1.3 NnHO2克隆 3
1.4 多序列比对和系统发育分析3
1.5 NnHO2三维结构建模3
1.6 HO2过表达载体构建4
1.7 烟草转基因材料与方法4
2 结果与分析 5
2.1荷花叶片RNA的提取结果5
2.2 荷花HO2基因CDS区的PCR扩增结果5
2.3 NnHO2蛋白的多序列比对6
2.4 NnHO2高级结构预测8
2.5 HO2过表达载体构建及烟草转基因8
2.6 烟草转基因9
3 讨论 11
致谢12
参考文献12
荷花HO2基因的克隆和功能鉴定
引言
引言
血红素加氧酶（Heme oxygenase, HO, EC 1.14.99.3）能使血红素（Heme）发生降解得到一氧化碳（c
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
arbon monoxide, CO）、胆绿素（BVIXa）和二价亚铁离子（Fe2+），是一种敏感、高效而普遍存在的酶。血红素加氧酶基因首先在鼠的肝脏中得到克隆。通过其酶促反应降解血红素产生胆绿素（BV）[1]，最终发现其作为一个单独的蛋白存在[2]。
过去十年间，已在许多物种中发现血红素加氧酶基因（HOs），其中一些已被鉴定[3]。然而，在光合生物中血红素加氧酶基因的存在首次在C.caldarium中被证实[4]，该藻类血红素加氧酶随后被测定[5]和得到一定程度的纯化。在高等植物中，光敏色素生色团（PφB）与胆藻素相似，而且BVIXα是PφB的前体，据此可以推测PφB的合成可能与胆藻素具有类似的途径[6]。血红素加氧酶（HO）在植物中的作用最终通过对不能合成PφB的突变体分析得到确认。随后，对拟南芥PφB缺乏突变体hy1的定位克隆表明受到影响的基因HY1与哺乳动物和蓝藻的血红素加氧酶基因（HOs）具有序列相似性[7]，而且其产物在体外具有血红素加氧酶活性[7]。后来在植物中该基因被命名为HO1。在不同的物种中数个同样的光形态建成突变体已被鉴定出，如水稻sec5，番茄yg2，豌豆pcd1；以及苔癣ptr116[8]。
作为一个定位于质体的酶，可以推测拟南芥HO1（AtHO1）与海藻中由质体基因组编码的血红素加氧酶（HOs）或蓝细菌中相应的酶非常相似。在高等植物，苔藓、被子植物（玉米、大麦、荷花、烟草、番茄、豌豆、大豆、水稻和高粱）、裸子植物及拟南芥[9]中已有HO基因被鉴定出。植物血红素加氧酶基因（HOs）是包含四个成员的小基因家族。依据蛋白质的氨基酸序列比对分析该家族被划分为两类，HO1类基因（包括拟南芥HO3和HO4）亚家族和HO2基因亚家族[10]。拟南芥血红素加氧酶基因家族的4个成员都能被转录，且表达模式高度相似[10]。Matsumoto等[11]的最新研究显示HO1表达量最高，HO2次之，HO3和HO4最低。
已发现高等植物血红素加氧酶（HOs）的氨基酸序列彼此间有很高的同源性，例如Glycine maxHO1（GmHO1）与AtHO1有71.1%的同源性，并且与来自其他植物中的HOs也有近似程度的同源性。相反，植物血红素加氧酶（HOs）与其他物种血红素加氧酶之间氨基酸序列的同源性却相当低，例如与SynHO1有21%，rHO1有22%，HmuO有23%，HemO有21%的同源性。氨基酸序列比对分析发现在人类HO1（或rHO1）中起催化作用的关键氨基酸残基为Gly139和Asp140，而GmHO1中却被丙氨酸和组氨酸所取代，尽管在GmHO1的整个序列中构成远端F螺旋部分的氨基酸残基十分保守[6]。最近，GmHO1的二级结构已被测定，结果表明GmHO1[6]包含与晶体结构已知的血红素加氧酶[12,13]相同的8个α螺旋，尽管在氨基酸序列上与其同源性很低。GmHO1的二级结构与豌豆的HO1相似。有研究指出HaemGmHO1复合体结构与SynHO1或rHO1的相似。然而，对植物中血红素加氧酶基因，蛋白结构和基因表达的研究有待进一步开展。
高等植物中，利用绿色荧光蛋白（GFP）和免疫印迹，已有研究证实HO1定位于叶绿体，且主要存在于叶绿体内腔中[7]。然而，目前还不清楚，HO1是由质体还是其他的基因组编码。虽然，HO1定位于叶绿体，但其他3种血红素加氧酶（HOs）的胞内分布仍不清楚。与HO1类似，HO2、HO3和HO4似乎也有一个N端叶绿体转移肽序列，但是，也可能定位于其他部位如线粒体，线粒体中的一些酶也能代谢含量高的含血红素蛋白质。最近的研究表明，一些N端氨基酸序列既能指导蛋白质进入线粒体也能指导蛋白质进入叶绿体，拟南芥的一个或多个血红素加氧酶（AtHOs）能分布在两种胞内空间，而其他植物中似乎不存在这种现象。
在转录水平上，植物中HO1基因能被许多因素上调，如光、紫外辐射、铁缺乏，活性氧（ROS）、脱落酸（ABA）、血红素（haematin）。传统的观点认为，植物HO 仅参与了光形态建成中介导光信号转导的主要感受红光和红外光的光敏色素生色团的生物合成[8,10,14]。目前，已在大肠杆菌中表达了拟南芥HO1、HO3和HO4基因，镉诱导大豆叶片中HO1的表达已被报道[10,14,15]。后来的研究揭示植物血红素加氧酶（HOs）能够保护细胞抵御氧化损伤[15,16]。最近，豌豆PsHO1基因已被表达，其酶活性也被检测[17]。已经获得以1:1与血红素结合的血红素加氧酶复合体。通过分解血红素产生CO和胆绿素(BVIX)，证实了豌豆中存在HO1酶活性。
近年来对植物HO基因方面的研究主要集中在一些模式植物上，如拟南芥（HY1）[7]、水稻（SE5）[18]、番茄（LeHO1）[8]、松树（PtHO1）[19]和豌豆（PsHO1）[17]等。因此，进一步研究HO基因在其它植物中的功能很有必要，且有助于深入理解植物发育和对各种胁迫反应的生理机制。本研究以荷花为研究材料。本文主要采用RTPCR技术，从荷花中克隆到荷花血红素加氧酶2（NnHO2）基因，并进行序列结构分析，系谱树构建和三维建模。在此基础上构建荷花HO2基因过表达载体，并进行了烟草转基因。
1 材料与方法
1．1 仪器
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 化学试剂与仪器 3
1.2 菌株和质粒载体 3
1.3 NnHO2克隆 3
1.4 多序列比对和系统发育分析3
1.5 NnHO2三维结构建模3
1.6 HO2过表达载体构建4
1.7 烟草转基因材料与方法4
2 结果与分析 5
2.1荷花叶片RNA的提取结果5
2.2 荷花HO2基因CDS区的PCR扩增结果5
2.3 NnHO2蛋白的多序列比对6
2.4 NnHO2高级结构预测8
2.5 HO2过表达载体构建及烟草转基因8
2.6 烟草转基因9
3 讨论 11
致谢12
参考文献12
荷花HO2基因的克隆和功能鉴定
引言
引言
血红素加氧酶（Heme oxygenase, HO, EC 1.14.99.3）能使血红素（Heme）发生降解得到一氧化碳（c
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
arbon monoxide, CO）、胆绿素（BVIXa）和二价亚铁离子（Fe2+），是一种敏感、高效而普遍存在的酶。血红素加氧酶基因首先在鼠的肝脏中得到克隆。通过其酶促反应降解血红素产生胆绿素（BV）[1]，最终发现其作为一个单独的蛋白存在[2]。
过去十年间，已在许多物种中发现血红素加氧酶基因（HOs），其中一些已被鉴定[3]。然而，在光合生物中血红素加氧酶基因的存在首次在C.caldarium中被证实[4]，该藻类血红素加氧酶随后被测定[5]和得到一定程度的纯化。在高等植物中，光敏色素生色团（PφB）与胆藻素相似，而且BVIXα是PφB的前体，据此可以推测PφB的合成可能与胆藻素具有类似的途径[6]。血红素加氧酶（HO）在植物中的作用最终通过对不能合成PφB的突变体分析得到确认。随后，对拟南芥PφB缺乏突变体hy1的定位克隆表明受到影响的基因HY1与哺乳动物和蓝藻的血红素加氧酶基因（HOs）具有序列相似性[7]，而且其产物在体外具有血红素加氧酶活性[7]。后来在植物中该基因被命名为HO1。在不同的物种中数个同样的光形态建成突变体已被鉴定出，如水稻sec5，番茄yg2，豌豆pcd1；以及苔癣ptr116[8]。
作为一个定位于质体的酶，可以推测拟南芥HO1（AtHO1）与海藻中由质体基因组编码的血红素加氧酶（HOs）或蓝细菌中相应的酶非常相似。在高等植物，苔藓、被子植物（玉米、大麦、荷花、烟草、番茄、豌豆、大豆、水稻和高粱）、裸子植物及拟南芥[9]中已有HO基因被鉴定出。植物血红素加氧酶基因（HOs）是包含四个成员的小基因家族。依据蛋白质的氨基酸序列比对分析该家族被划分为两类，HO1类基因（包括拟南芥HO3和HO4）亚家族和HO2基因亚家族[10]。拟南芥血红素加氧酶基因家族的4个成员都能被转录，且表达模式高度相似[10]。Matsumoto等[11]的最新研究显示HO1表达量最高，HO2次之，HO3和HO4最低。
已发现高等植物血红素加氧酶（HOs）的氨基酸序列彼此间有很高的同源性，例如Glycine maxHO1（GmHO1）与AtHO1有71.1%的同源性，并且与来自其他植物中的HOs也有近似程度的同源性。相反，植物血红素加氧酶（HOs）与其他物种血红素加氧酶之间氨基酸序列的同源性却相当低，例如与SynHO1有21%，rHO1有22%，HmuO有23%，HemO有21%的同源性。氨基酸序列比对分析发现在人类HO1（或rHO1）中起催化作用的关键氨基酸残基为Gly139和Asp140，而GmHO1中却被丙氨酸和组氨酸所取代，尽管在GmHO1的整个序列中构成远端F螺旋部分的氨基酸残基十分保守[6]。最近，GmHO1的二级结构已被测定，结果表明GmHO1[6]包含与晶体结构已知的血红素加氧酶[12,13]相同的8个α螺旋，尽管在氨基酸序列上与其同源性很低。GmHO1的二级结构与豌豆的HO1相似。有研究指出HaemGmHO1复合体结构与SynHO1或rHO1的相似。然而，对植物中血红素加氧酶基因，蛋白结构和基因表达的研究有待进一步开展。
高等植物中，利用绿色荧光蛋白（GFP）和免疫印迹，已有研究证实HO1定位于叶绿体，且主要存在于叶绿体内腔中[7]。然而，目前还不清楚，HO1是由质体还是其他的基因组编码。虽然，HO1定位于叶绿体，但其他3种血红素加氧酶（HOs）的胞内分布仍不清楚。与HO1类似，HO2、HO3和HO4似乎也有一个N端叶绿体转移肽序列，但是，也可能定位于其他部位如线粒体，线粒体中的一些酶也能代谢含量高的含血红素蛋白质。最近的研究表明，一些N端氨基酸序列既能指导蛋白质进入线粒体也能指导蛋白质进入叶绿体，拟南芥的一个或多个血红素加氧酶（AtHOs）能分布在两种胞内空间，而其他植物中似乎不存在这种现象。
在转录水平上，植物中HO1基因能被许多因素上调，如光、紫外辐射、铁缺乏，活性氧（ROS）、脱落酸（ABA）、血红素（haematin）。传统的观点认为，植物HO 仅参与了光形态建成中介导光信号转导的主要感受红光和红外光的光敏色素生色团的生物合成[8,10,14]。目前，已在大肠杆菌中表达了拟南芥HO1、HO3和HO4基因，镉诱导大豆叶片中HO1的表达已被报道[10,14,15]。后来的研究揭示植物血红素加氧酶（HOs）能够保护细胞抵御氧化损伤[15,16]。最近，豌豆PsHO1基因已被表达，其酶活性也被检测[17]。已经获得以1:1与血红素结合的血红素加氧酶复合体。通过分解血红素产生CO和胆绿素(BVIX)，证实了豌豆中存在HO1酶活性。
近年来对植物HO基因方面的研究主要集中在一些模式植物上，如拟南芥（HY1）[7]、水稻（SE5）[18]、番茄（LeHO1）[8]、松树（PtHO1）[19]和豌豆（PsHO1）[17]等。因此，进一步研究HO基因在其它植物中的功能很有必要，且有助于深入理解植物发育和对各种胁迫反应的生理机制。本研究以荷花为研究材料。本文主要采用RTPCR技术，从荷花中克隆到荷花血红素加氧酶2（NnHO2）基因，并进行序列结构分析，系谱树构建和三维建模。在此基础上构建荷花HO2基因过表达载体，并进行了烟草转基因。
1 材料与方法
1．1 仪器
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