农杆菌介导君迁子遗传转化体系的建立
本次研究在已有的君迁子高效再生体系的基础上，对影响根癌农杆菌介导的君迁子遗传转化条件进行探究。并初步确立君迁子叶片的遗传转化工艺路径。主要研究结果如下研究了筛选抗生素潮霉素和抑菌抗生素头孢对叶片分化不定芽的影响。结果选择0.6mg/L潮霉素作为筛选抗性芽浓度和500mg/L的头孢来抑制农杆菌生长效果较好。研究了预培养时间、农杆菌侵染浓度、侵染时间、共培养时间4个条件对君迁子叶片再生的影响，初步确立了遗传转化体系。取君迁子组培苗顶端第2~3展开叶，切成4mm×4mm大小，接种在培养基MS1（MS+琼脂0.6%+蔗糖40g/L+PVP(聚乙烯吡咯烷酮)0.1% + TDZ 3mg/L+NAA 0.1mg/L）上，黑暗条件下，预培养3天后，用OD600值为0.4的菌液侵染叶片10min，再转到培养基MS1上，共培养4天后转到含有0.6mg/L潮霉素和500mg/L的头孢的筛选培养基上，暗培养10天。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 植物材料与转化载体2
1.1.2 培养基类型 3
1.1.3 仪器 3
1.2 方法 3
1.2.1 君迁子对抗生素的敏感性实验3
1.2.1.1 君迁子对潮霉素的敏感性实验3
1.2.1.2 君迁子对不同浓度抑菌抗生素的敏感性实验3
1.2.2 转化程序3
1.2.3 不同预培养时间对君迁子遗传转化的影响4
1.2.4 农杆菌菌液浓度对君迁子遗传转化的影响4
1.2.5 农杆菌侵染时间对君迁子遗传转化的影响4
1.2.6 共培养时间对君迁子遗传转化的影响4
2 结果与分析4
2.1 君迁子对潮霉素敏感性4
2.2 君迁子对抑菌抗生素的敏感性5
2.3 预培养时间对君迁子叶片的影响 5
2.4 菌液浓度对君迁子叶片的影响6
2.5 侵染时间对君迁子叶片的影响6
2.6 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
共培养时间对君迁子叶片的影响7
3 讨论 7
4 结论8
致谢8
参考文献8
图1 9图2 9 农杆菌介导君迁子遗传转化体系的建立
引言
引言
君迁子（Diospyros lotus L）别名黑枣、软枣、丁香枣，是柿科（Ebenaceae）柿属（Diospyros lotus）植物的一个种。其在我国种质资源丰富，并分布广泛，绝大部分省市均有生长。经济果树，绝大部分是雌雄异株，果树形状扁圆、椭圆、圆等，果实大多有核，也有无核类型。可生食、酿果醋与果酒。实生苗移栽成活率较高，并且抗寒性极强与柿嫁接亲和性强，因此作为北方柿树主要的砧木品种。
农杆菌是一类革兰氏阴性杆菌，并分为根癌农杆菌和发根农杆菌，前者含有Ti质粒，后者则是Ri质粒，在自然情况下它们通过伤口侵染植物，导致伤部冠瘿瘤或毛发根。
Ti质粒（或Ri质粒）是大小约为200~250kb的双链共价闭合环分子，是农杆菌染色体外一套独立的遗传物质，其上根据功能不同分为4个区，分别是TDNA区、毒性区（Virulence region,vir区）、接合转移区、复制起始区，其中TDNA区和Vir区较为重要。TDNA区两端边界是各为25bp的重复序列，是TDNA转移所必需的,只要有这两个边界序列，便能实现切割、转移整合，转移的方向是从右向左，通过右边界来整合进植物细胞核内的DNA。
植物受伤后，会分泌出乙酰丁香酮等酚类物质，这些物质则为信号因子，Ti质粒中的Vir收到刺激便开始做出反应。首先，VirA蛋白感受刺激，激活了VirA/G双分子调控体系，进而诱导农杆菌其他毒性基因的表达。其中VirD基因表达的VirD1/VirD2二聚体作用在TDNA特定的酶切位点上进行切割，在 T DNA 产生缺口后, Vir D2 共价结合在 T DNA 的5末端, 形成转运T复合体, 然后可能会通过细菌解旋酶的作用, 使形成的Vir D2T链复合体被释放出来。农杆菌通过Ⅳ型分泌系统转运 T 复合体和一些细菌蛋白,这些转运蛋白由VirB、VirE等构成，与T复合体一同跨过植物细胞壁和细胞膜。植物宿主体内合成的某些蛋白也是TDNA胞内运输以及能够进核共价接合的关键因素，但目前，深入研究的主要是农杆菌自身相关的侵染机理，在TDNA进入植物细胞后，来自宿主协助TDNA的蛋白及相关机理还未进行研究，对于这些仍需要我们不懈的努力与探索，去揭开一层层农杆菌侵染的面纱。
前人在研究如何提高农杆菌遗传转化率上下了不少功夫，在影响农杆菌转化的因素上面大致分为转基因受体、农杆菌自身本质，侵染过程的处理、共培养的条件、筛选药物这几个方面。
转基因受体方面包括外植体部位和基因型类型，虽然大自然中各物种不尽相同，但一般来说幼嫩的部位容易有较高的转化率，从理论方面出发，是由于其细胞分裂能力旺盛，而细胞分裂能力是高转化的基础，因此幼嫩部和愈伤组织易作为外植体。农杆菌方面，不同菌株侵染不同植物会有不同的转化率，同一种菌株在某一种植物上转化率低，但在另一种上面就有很高的表现，这种情况有点类似“特异性结合”，当然也有菌株对大多数植物都表现出较好的转化率，这类变很适合作为实验工程菌来培养。其次，在转化过程中一些操作也会提高转化率，如农杆菌菌液侵染浓度，侵染时间，一般来说农杆菌对植物是损害的，当超过某一定限度，植物则会因农杆菌的毒害而死亡；而低于某一限度，那么与外植体发生接触的农杆菌数量较少，而导致转化率极低。
近年来，农杆菌介导法应用领域逐渐扩大，随着对转化机制深入研究与操作方法的改进，不仅改变了农杆菌只能局限于双子叶植物的观点，农杆菌遗传转化在单子叶植物方面也取得了重大突破和多项成果，在单子叶植物成功转化方面包括石蒜科、百合科、鸢尾科、薯蓣科和禾本科等，而转化方法上,除活体接种法、共培养转化法、叶盘转化法外、有人还先用超声波或电穿孔法处理植物细胞或组织后再用农杆菌去感染,也收到了很好的效果。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 植物材料与转化载体2
1.1.2 培养基类型 3
1.1.3 仪器 3
1.2 方法 3
1.2.1 君迁子对抗生素的敏感性实验3
1.2.1.1 君迁子对潮霉素的敏感性实验3
1.2.1.2 君迁子对不同浓度抑菌抗生素的敏感性实验3
1.2.2 转化程序3
1.2.3 不同预培养时间对君迁子遗传转化的影响4
1.2.4 农杆菌菌液浓度对君迁子遗传转化的影响4
1.2.5 农杆菌侵染时间对君迁子遗传转化的影响4
1.2.6 共培养时间对君迁子遗传转化的影响4
2 结果与分析4
2.1 君迁子对潮霉素敏感性4
2.2 君迁子对抑菌抗生素的敏感性5
2.3 预培养时间对君迁子叶片的影响 5
2.4 菌液浓度对君迁子叶片的影响6
2.5 侵染时间对君迁子叶片的影响6
2.6 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
共培养时间对君迁子叶片的影响7
3 讨论 7
4 结论8
致谢8
参考文献8
图1 9图2 9 农杆菌介导君迁子遗传转化体系的建立
引言
引言
君迁子（Diospyros lotus L）别名黑枣、软枣、丁香枣，是柿科（Ebenaceae）柿属（Diospyros lotus）植物的一个种。其在我国种质资源丰富，并分布广泛，绝大部分省市均有生长。经济果树，绝大部分是雌雄异株，果树形状扁圆、椭圆、圆等，果实大多有核，也有无核类型。可生食、酿果醋与果酒。实生苗移栽成活率较高，并且抗寒性极强与柿嫁接亲和性强，因此作为北方柿树主要的砧木品种。
农杆菌是一类革兰氏阴性杆菌，并分为根癌农杆菌和发根农杆菌，前者含有Ti质粒，后者则是Ri质粒，在自然情况下它们通过伤口侵染植物，导致伤部冠瘿瘤或毛发根。
Ti质粒（或Ri质粒）是大小约为200~250kb的双链共价闭合环分子，是农杆菌染色体外一套独立的遗传物质，其上根据功能不同分为4个区，分别是TDNA区、毒性区（Virulence region,vir区）、接合转移区、复制起始区，其中TDNA区和Vir区较为重要。TDNA区两端边界是各为25bp的重复序列，是TDNA转移所必需的,只要有这两个边界序列，便能实现切割、转移整合，转移的方向是从右向左，通过右边界来整合进植物细胞核内的DNA。
植物受伤后，会分泌出乙酰丁香酮等酚类物质，这些物质则为信号因子，Ti质粒中的Vir收到刺激便开始做出反应。首先，VirA蛋白感受刺激，激活了VirA/G双分子调控体系，进而诱导农杆菌其他毒性基因的表达。其中VirD基因表达的VirD1/VirD2二聚体作用在TDNA特定的酶切位点上进行切割，在 T DNA 产生缺口后, Vir D2 共价结合在 T DNA 的5末端, 形成转运T复合体, 然后可能会通过细菌解旋酶的作用, 使形成的Vir D2T链复合体被释放出来。农杆菌通过Ⅳ型分泌系统转运 T 复合体和一些细菌蛋白,这些转运蛋白由VirB、VirE等构成，与T复合体一同跨过植物细胞壁和细胞膜。植物宿主体内合成的某些蛋白也是TDNA胞内运输以及能够进核共价接合的关键因素，但目前，深入研究的主要是农杆菌自身相关的侵染机理，在TDNA进入植物细胞后，来自宿主协助TDNA的蛋白及相关机理还未进行研究，对于这些仍需要我们不懈的努力与探索，去揭开一层层农杆菌侵染的面纱。
前人在研究如何提高农杆菌遗传转化率上下了不少功夫，在影响农杆菌转化的因素上面大致分为转基因受体、农杆菌自身本质，侵染过程的处理、共培养的条件、筛选药物这几个方面。
转基因受体方面包括外植体部位和基因型类型，虽然大自然中各物种不尽相同，但一般来说幼嫩的部位容易有较高的转化率，从理论方面出发，是由于其细胞分裂能力旺盛，而细胞分裂能力是高转化的基础，因此幼嫩部和愈伤组织易作为外植体。农杆菌方面，不同菌株侵染不同植物会有不同的转化率，同一种菌株在某一种植物上转化率低，但在另一种上面就有很高的表现，这种情况有点类似“特异性结合”，当然也有菌株对大多数植物都表现出较好的转化率，这类变很适合作为实验工程菌来培养。其次，在转化过程中一些操作也会提高转化率，如农杆菌菌液侵染浓度，侵染时间，一般来说农杆菌对植物是损害的，当超过某一定限度，植物则会因农杆菌的毒害而死亡；而低于某一限度，那么与外植体发生接触的农杆菌数量较少，而导致转化率极低。
近年来，农杆菌介导法应用领域逐渐扩大，随着对转化机制深入研究与操作方法的改进，不仅改变了农杆菌只能局限于双子叶植物的观点，农杆菌遗传转化在单子叶植物方面也取得了重大突破和多项成果，在单子叶植物成功转化方面包括石蒜科、百合科、鸢尾科、薯蓣科和禾本科等，而转化方法上,除活体接种法、共培养转化法、叶盘转化法外、有人还先用超声波或电穿孔法处理植物细胞或组织后再用农杆菌去感染,也收到了很好的效果。
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