亚硒酸钠调控小白菜幼苗内源
:为了研究亚硒酸钠对汞（Hg）胁迫下小白菜根长的影响，本实验以小白菜为试材，研究了硒（Se）对其Hg毒害的缓解作用,并利用硫化氢（H2S）探针分析不同处理下小白菜内源H2S的变化，证明Se通过气体信号分子H2S缓解Hg对小白菜胁迫。结果表明(1)Hg能显著抑制小白菜根长生长，Se能够在一定程度上缓解Hg对小白菜幼苗根生长的抑制作用，而且在一定浓度时，对小白菜根生长影响不显著；(2)Se可能通过改变小白菜根尖内源H2S含量降低Hg对小白菜的胁迫，从而缓解Hg对小白菜根长的抑制作用；(3)抑制或清除Hg处理下的小白菜根部内源H2S能够在一定程度上缓解Hg对小白菜根部的抑制作用。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 实验材料 2
1.2 实验试剂 2
1.3 实验仪器 2
1.4 实验方法 2
1.4.1 实验设计 2
1.4.2 植株培养 3
1.4.3 指标测定 3
1.5 数据处理 3
2 结果与分析 3
2.1 汞处理对小白菜根长的影响 3
2.2 硒对汞胁迫下小白菜根长生长的影响 3
2.3 硒对汞胁迫下小白菜根部内源H2S的影响 4
2.4 H2S产生抑制剂与清除剂缓解汞对小白菜毒害 4
2.5 H2S清除剂与抑制剂对小白菜内源H2S含量影响 5
3 讨论 6
致谢 6
参考文献 6
亚硒酸钠调控小白菜幼苗内源H2S缓解汞毒害研究
引言
引言
小白菜（Brassica rapa L.Chinensis Group）又称青菜、油菜，属于十字花科芸薹属植物，具有栽培简单、口味鲜嫩、营养价值高等特点，另外由于小白菜适应性强，可四季栽培，是人们主要食用的绿叶蔬菜。但是由于矿区特殊环境、重金属制品的使用等原因导致自然环境中重金属污染日益严重，研究发现我国耕地的重金属污染面积占耕地总量的1/6左右[1]，其中汞是 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
其中主要的污染物之一。汞毒害主要由于它的剧毒性、可移动性和生物积累，对动植物生长造成损害而且对人类健康构成严重威胁。
植物中的汞主要来源于土壤。目前，众多学者致力于重金属修复相关研究[2,3]，主要通过土壤微生物、植物生长调节剂、离子拮抗和基因工程提高植物对重金属抗性[4]。其中利用硒在缓解植物重金属胁迫方面已经取得了一定的进展。研究表明，施硒能降低大白菜对镉的吸收与累积[5]；可减轻镉对水稻幼苗的毒害，从而提高叶绿素含量、苗鲜重，增加叶片干物质积累，提高叶片还原糖含量，降低 MDA含量与POD活性，提高SOD与 CAT 活性等[6,7]；硒还可以在绿豆苗期缓解铅导致的叶绿素、过氧化氢酶下降，细胞膜透性增加[8]。关于硒缓解汞毒害的相关研究还不多，而且关于硒缓解重金属污染的机理还不是很明确。
H2S是近年发现的继NO和CO之后的第三种内源气体信号分子，研究表明在动物体内H2S以信号分子的形式参与了多种生理活动[9,10]。研究发现NO能够缓解水稻镉毒害[11]、小麦镍毒害[12]以及黄瓜盐胁迫下幼苗生长[13]。但H2S是否能够像NO和CO一样缓解逆境胁迫下植物氧化损伤研究还相当匾乏。在哺乳动物中H2S主要通过胱硫醚γ裂解酶(CSE, cystathionineγlyase)、胱硫醚β合成酶(CBS, cystathionineβsynthase)和3巯基丙酮酸盐硫转移酶(MST, 3mercaptopyruvate sulphurtransferase)分解半胱氨酸（Cys, cysteine）产生[14]。植物中H2S的产生主要是D半胱氨酸脱巯基酶(Dcysteine desulfhydrase, DCD, EC 4.4.1.1)和L半胱氨酸脱巯基酶(Lcysteine desulfhydrase, LCD, EC4.4.1.15)催化Cys分解产生[14]。作为一种气体信号分子，金竹萍等[15]认为H2S参与了植物生长发育的整个生命过程。外源H2S能够缓解水分胁迫下玉米种子的萌发和生长[16]，而且H2S供体硫氢化钠处理小麦种子能够提高其对高温和干旱的抵抗能力[17]。另外H2S的检测限制了H2S的相关研究。目前H2S研究主要包括微电极或电流传感器检测和检测植物释放的H2S气体。而类似于NO荧光探针活体检测植物内源H2S的方法还未得到广泛应用。目前已有报道的H2S特异性荧光探针有SF1、SF2、SFP1、WSP1等[1820]。本文以小白菜为材料，探讨硒对重金属汞胁迫的缓解作用，并以H2S特异性荧光探针监测小白菜内源H2S含量变化，为硒是否通过H2S缓解重金属对植物产生胁迫效应提供理论基础。
1 材料与方法
1.1实验材料
本实验于2013年8月至2014年3月在江苏省农业科学院进行。供试小白菜品种为南京绿领种业生产的五月慢。
1.2实验试剂
氯化汞（HgCl2，mercury chloride购自国药集团）
亚硒酸钠（Na2SeO3，sodium?selenite 购自国药集团）
硫氢化钠（NaHS，sodium hydrosulfide 购自sigma公司）
亚牛磺酸（HT，Hypotaurine购自sigma公司）
炔丙基甘氨酸(PAG，lpropargylglycine购自sigma公司)
硫化氢荧光探针WPS1[3′ methoxy 3 oxo 3H spiro[isobenzofuran 1, 9′ xanthen] 6′ yl2 (pyridin 2 yldisulfanyl)ebenzoate]，由华盛顿大学生化系Prof. Ming Xian惠赠。
1.3实验仪器
AR5120 电子天平(美国 AHOΜS公司)；智能光照培养箱（购自宁波江南仪器厂）；荧光显微镜(ECLIPSE， TE2000S，Nikon)。
1.4实验方法
1.4.1 实验设计
实验前期设置HgCl2 7个浓度梯度：CK（清水）、 0.25 uM、 0.5 uM、1 uM、 1.5 uM、2 uM、4 uM。每个处理设置三个重复。选取抑制率在50%左右的HgCl2浓度作为后续实验的汞处理浓度。探究硒缓解汞毒害的试验中分别设置：CK、Hg 1.5 uM 、Hg 1.5 uM + Se 0.5 uM、Se 0.5 uM四个处理，采用亚硒酸钠作为硒源。
1.4.2植株培养
种子催芽前用1% NaClO浸泡10分钟，用双蒸水冲洗3次，将小白菜种子均匀铺在垫有湿润滤纸的培养皿中，在25℃条件下避光催芽24小时。采用营养液培的方法，将萌发一致的种子铺有纱网的浮板上培养，营养液采用1/2 Hoagland营养液，待苗根长长至1cm左右进行处理，每盆20棵，各浓度分别作3个平行，昼夜培养温度25℃/22℃，相对湿度75%，光照周期14 h/10 h，pH 6.0[21]。1.5 uM HgCl2处理后分别在12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h取样测定根长，其余处理72 h取样测定根长、内源H2S荧光强度。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 实验材料 2
1.2 实验试剂 2
1.3 实验仪器 2
1.4 实验方法 2
1.4.1 实验设计 2
1.4.2 植株培养 3
1.4.3 指标测定 3
1.5 数据处理 3
2 结果与分析 3
2.1 汞处理对小白菜根长的影响 3
2.2 硒对汞胁迫下小白菜根长生长的影响 3
2.3 硒对汞胁迫下小白菜根部内源H2S的影响 4
2.4 H2S产生抑制剂与清除剂缓解汞对小白菜毒害 4
2.5 H2S清除剂与抑制剂对小白菜内源H2S含量影响 5
3 讨论 6
致谢 6
参考文献 6
亚硒酸钠调控小白菜幼苗内源H2S缓解汞毒害研究
引言
引言
小白菜（Brassica rapa L.Chinensis Group）又称青菜、油菜，属于十字花科芸薹属植物，具有栽培简单、口味鲜嫩、营养价值高等特点，另外由于小白菜适应性强，可四季栽培，是人们主要食用的绿叶蔬菜。但是由于矿区特殊环境、重金属制品的使用等原因导致自然环境中重金属污染日益严重，研究发现我国耕地的重金属污染面积占耕地总量的1/6左右[1]，其中汞是 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
其中主要的污染物之一。汞毒害主要由于它的剧毒性、可移动性和生物积累，对动植物生长造成损害而且对人类健康构成严重威胁。
植物中的汞主要来源于土壤。目前，众多学者致力于重金属修复相关研究[2,3]，主要通过土壤微生物、植物生长调节剂、离子拮抗和基因工程提高植物对重金属抗性[4]。其中利用硒在缓解植物重金属胁迫方面已经取得了一定的进展。研究表明，施硒能降低大白菜对镉的吸收与累积[5]；可减轻镉对水稻幼苗的毒害，从而提高叶绿素含量、苗鲜重，增加叶片干物质积累，提高叶片还原糖含量，降低 MDA含量与POD活性，提高SOD与 CAT 活性等[6,7]；硒还可以在绿豆苗期缓解铅导致的叶绿素、过氧化氢酶下降，细胞膜透性增加[8]。关于硒缓解汞毒害的相关研究还不多，而且关于硒缓解重金属污染的机理还不是很明确。
H2S是近年发现的继NO和CO之后的第三种内源气体信号分子，研究表明在动物体内H2S以信号分子的形式参与了多种生理活动[9,10]。研究发现NO能够缓解水稻镉毒害[11]、小麦镍毒害[12]以及黄瓜盐胁迫下幼苗生长[13]。但H2S是否能够像NO和CO一样缓解逆境胁迫下植物氧化损伤研究还相当匾乏。在哺乳动物中H2S主要通过胱硫醚γ裂解酶(CSE, cystathionineγlyase)、胱硫醚β合成酶(CBS, cystathionineβsynthase)和3巯基丙酮酸盐硫转移酶(MST, 3mercaptopyruvate sulphurtransferase)分解半胱氨酸（Cys, cysteine）产生[14]。植物中H2S的产生主要是D半胱氨酸脱巯基酶(Dcysteine desulfhydrase, DCD, EC 4.4.1.1)和L半胱氨酸脱巯基酶(Lcysteine desulfhydrase, LCD, EC4.4.1.15)催化Cys分解产生[14]。作为一种气体信号分子，金竹萍等[15]认为H2S参与了植物生长发育的整个生命过程。外源H2S能够缓解水分胁迫下玉米种子的萌发和生长[16]，而且H2S供体硫氢化钠处理小麦种子能够提高其对高温和干旱的抵抗能力[17]。另外H2S的检测限制了H2S的相关研究。目前H2S研究主要包括微电极或电流传感器检测和检测植物释放的H2S气体。而类似于NO荧光探针活体检测植物内源H2S的方法还未得到广泛应用。目前已有报道的H2S特异性荧光探针有SF1、SF2、SFP1、WSP1等[1820]。本文以小白菜为材料，探讨硒对重金属汞胁迫的缓解作用，并以H2S特异性荧光探针监测小白菜内源H2S含量变化，为硒是否通过H2S缓解重金属对植物产生胁迫效应提供理论基础。
1 材料与方法
1.1实验材料
本实验于2013年8月至2014年3月在江苏省农业科学院进行。供试小白菜品种为南京绿领种业生产的五月慢。
1.2实验试剂
氯化汞（HgCl2，mercury chloride购自国药集团）
亚硒酸钠（Na2SeO3，sodium?selenite 购自国药集团）
硫氢化钠（NaHS，sodium hydrosulfide 购自sigma公司）
亚牛磺酸（HT，Hypotaurine购自sigma公司）
炔丙基甘氨酸(PAG，lpropargylglycine购自sigma公司)
硫化氢荧光探针WPS1[3′ methoxy 3 oxo 3H spiro[isobenzofuran 1, 9′ xanthen] 6′ yl2 (pyridin 2 yldisulfanyl)ebenzoate]，由华盛顿大学生化系Prof. Ming Xian惠赠。
1.3实验仪器
AR5120 电子天平(美国 AHOΜS公司)；智能光照培养箱（购自宁波江南仪器厂）；荧光显微镜(ECLIPSE， TE2000S，Nikon)。
1.4实验方法
1.4.1 实验设计
实验前期设置HgCl2 7个浓度梯度：CK（清水）、 0.25 uM、 0.5 uM、1 uM、 1.5 uM、2 uM、4 uM。每个处理设置三个重复。选取抑制率在50%左右的HgCl2浓度作为后续实验的汞处理浓度。探究硒缓解汞毒害的试验中分别设置：CK、Hg 1.5 uM 、Hg 1.5 uM + Se 0.5 uM、Se 0.5 uM四个处理，采用亚硒酸钠作为硒源。
1.4.2植株培养
种子催芽前用1% NaClO浸泡10分钟，用双蒸水冲洗3次，将小白菜种子均匀铺在垫有湿润滤纸的培养皿中，在25℃条件下避光催芽24小时。采用营养液培的方法，将萌发一致的种子铺有纱网的浮板上培养，营养液采用1/2 Hoagland营养液，待苗根长长至1cm左右进行处理，每盆20棵，各浓度分别作3个平行，昼夜培养温度25℃/22℃，相对湿度75%，光照周期14 h/10 h，pH 6.0[21]。1.5 uM HgCl2处理后分别在12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h取样测定根长，其余处理72 h取样测定根长、内源H2S荧光强度。
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