菊花热激转录因子cmhsf4a基因的克隆及其功能鉴定
本研究从菊花中克隆了CmHSF4A基因，分析其表达特性，并对超表达CmHSF4A的转基因株系进行耐盐性鉴定和生理指标的检测，研究结果如下同源克隆CmHSF4A基因，开放阅读框（ORF）1077bp，CmHSF4A受盐胁迫的明显诱导，表现出组织特异性；对CmHSF4A超表达转基因菊花的耐盐性鉴定发现，两个转基因菊花株系较对照耐盐性明显提高。H2O2及O2?-含量测定及活性氧清除酶酶活测定发现，转基因菊花的活性氧含量低于野生型，相应的，其清除酶酶活性高于野生型，表明CmHSF4A转基因菊花有较强的活性氧清除能力，推测CmHSF4A可通过促进转基因植株活性氧清除能力的提高，从而增强植物的耐盐性。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引 言 1
1 材料与方法 2
1.1 植物材料、表达载体与菌株 2
1.2 CmHSF4A基因克隆 2
1.2.1 RNA提取 3
1.2.2 去基因组DNA及第一链cDNA合成 3
1.3 CmHSF4A基因的表达特性分析 4
1.4 CmHSF4A转基因菊花耐盐性鉴定及耐盐机理 5
1.4.1 转基因植株的盐处理及耐盐性鉴定 5
1.4.2 转基因植株盐胁迫下生理指标的检测 5
1.5 数据分析 5
2 结果与分析 5
2.1 CmHSF4A基因克隆 5
2.2 CmHSF4A表达特性 5
2.2.1 不同组织器官中CmHSF4A的表达特性 5
2.2.2 盐胁迫下CmHSF4A的表达分析 6
2.3 CmHSF4A转基因菊花耐盐性鉴定及耐盐机理 6
2.3.1 转基因植株盐胁迫下存活率分析 6
2.3.2 转基因植株盐胁迫下活性氧水平及其清除酶活性 7
3 讨论 7
3.1 CmHSF4A序列特征及耐盐性功能 7
3.2 CmHSF4A通过减少活性氧累积及增加活性氧清除能力提高耐盐性 8
致谢 8
参考 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
文献 9
菊花热激转录因子CmHSF4A基因的克隆及其功能鉴定
引言
菊花(Chrysanthum morifolium)为菊科菊属草本观赏植物，原产自我国，已有三千多年的栽培历史[1]。是我国十大名花和世界四大切花之一，其切花消费量在全球仅次于月季。我国从上世纪八十年代就开始了切花菊的生产，目前切花菊已成为高效农业行业的一员。经过多年的实践研究，我国切花菊产业发展迅速，已达到周年供应的水平[2]。但不少菊花品种对高盐环境缺乏耐性，其在我国沿海及北方的干旱和半干旱地区等盐渍化严重地区的栽培和应用受到很大限制，此外，在切花菊集约化设施生产中，土壤盐渍化或次生盐渍化会造成植物萎蔫、黄化甚至死亡[3]。菊花产量和品质受到严重影响，经济损失很大。但是，对于盐渍化土壤的改良由于受到自然因素、资金条件的严重限制，效果不明显，且适用范围很有限[3]，因此，培育具有优良抗性性状的菊花新品种是菊花现代育种的重要目标。
盐分胁迫时，植物细胞质膜受损，脂质的过氧化作用加速，胞内活性氧类物质迅速积累，超出细胞的清除能力，因此活性氧积累对细胞造成伤害，维持植物细胞区域化的膜系统被损伤甚至瓦解；活性氧与色氨酸残基或酶蛋白的巯基发生反应导致酶失活；活性氧破坏核酸结构，产生变异并积累；伤害DNA复制过程，蛋白质的合成被破坏[4]。此外，当植物在遭受盐等胁迫，其光合能力降低，光抑制发生，由此碳同化下降，光合电子传递链的过还原，过多的电子会因此而传给分子氧，导致氧气的单价还原或原子排序的异常，从而导致ROS的形成[5]。盐胁迫环境下诱导产生的活性氧引起膜质过氧化，为了减少盐胁迫下细胞的脂质损伤，植物在长期进化中，自身形成了一套活性氧清除系统。活性氧清除系统包括酶促防御系统和非酶促防御系统。酶促防御系统包括SOD、POD、CAT、APX、GR在内，这些保护酶活性的增强能够提高植物的耐盐能力[6]。SOD能够催化O2?转化成H2O2和O2，减轻氧化胁迫对细胞的伤害。非酶促防御系统主要由抗坏血酸AsA，GSH等直接与ROS发生反应。APX及CAT是清除H2O2的主要酶，在抗氧化胁迫过程中发挥着重要作用[7]。
形态解剖结构的变化也使得植物在进化过程中逐渐适应逆境并完成生活史，如表皮毛、乳状突起或腺毛等有利于防止蒸腾和排出盐分[8]。
此外，植物在盐胁迫下，土壤中离子浓度较高，植物细胞内部的水势高于胞外，从而导致细胞缺水。在不断进化的过程中，植物形成了渗透调节的生理机制，以增加细胞溶质浓度，降低胞内水势，维持细胞正常膨压，从而缓解由于脱水胁迫造成的伤害，提高植物的耐盐性[9]。无机渗透调节和有机渗透调节共同参与植物的渗透调节，无机渗透调节主要通过离子的选择性吸收和离子的区域化作用来调节体内的离子稳态，最终形成胞外、胞质、液泡三者之间的离子平衡[10]。但是，无机离子浓度过高会对细胞造成损伤，为了避免细胞质面临液泡和外部环境的双重压迫，因此，植物还会合成有机的亲和渗透调节物质来平衡细胞内外的渗透势，从而酶分子的构象和大分子物质的稳定得到维持[11]。细胞中合成的有机的亲和渗透调节物质主要有：氨基酸及其衍生物（如脯氨酸、甜菜碱等）、低分子糖类（如海藻糖、果聚糖等）、多元醇（如山梨醇、甘露醇等）。
植物热激转录因子（heat stress transcription factors）HSFs是存在于细胞内调节热激蛋白表达的一类转录调节基因，在植物热胁迫信号转导和耐热性的产生过程中发挥重要作用。当植物受到非生物胁迫如高温、干旱、低温和生物胁迫如昆虫取食、病原菌侵染，尤其是热胁迫（heat stress, HS） 时，植物会产生一系列的应激反应，热激转录因子被激活，通过基因活性的调节，对胁迫进行响应。然而在菊花中，关于HSF研究的报道相对较少，开展菊花相关HSF的克隆和功能鉴定对于菊花抗逆性分子机制解析及抗性分子奠定重要基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引 言 1
1 材料与方法 2
1.1 植物材料、表达载体与菌株 2
1.2 CmHSF4A基因克隆 2
1.2.1 RNA提取 3
1.2.2 去基因组DNA及第一链cDNA合成 3
1.3 CmHSF4A基因的表达特性分析 4
1.4 CmHSF4A转基因菊花耐盐性鉴定及耐盐机理 5
1.4.1 转基因植株的盐处理及耐盐性鉴定 5
1.4.2 转基因植株盐胁迫下生理指标的检测 5
1.5 数据分析 5
2 结果与分析 5
2.1 CmHSF4A基因克隆 5
2.2 CmHSF4A表达特性 5
2.2.1 不同组织器官中CmHSF4A的表达特性 5
2.2.2 盐胁迫下CmHSF4A的表达分析 6
2.3 CmHSF4A转基因菊花耐盐性鉴定及耐盐机理 6
2.3.1 转基因植株盐胁迫下存活率分析 6
2.3.2 转基因植株盐胁迫下活性氧水平及其清除酶活性 7
3 讨论 7
3.1 CmHSF4A序列特征及耐盐性功能 7
3.2 CmHSF4A通过减少活性氧累积及增加活性氧清除能力提高耐盐性 8
致谢 8
参考 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
文献 9
菊花热激转录因子CmHSF4A基因的克隆及其功能鉴定
引言
菊花(Chrysanthum morifolium)为菊科菊属草本观赏植物，原产自我国，已有三千多年的栽培历史[1]。是我国十大名花和世界四大切花之一，其切花消费量在全球仅次于月季。我国从上世纪八十年代就开始了切花菊的生产，目前切花菊已成为高效农业行业的一员。经过多年的实践研究，我国切花菊产业发展迅速，已达到周年供应的水平[2]。但不少菊花品种对高盐环境缺乏耐性，其在我国沿海及北方的干旱和半干旱地区等盐渍化严重地区的栽培和应用受到很大限制，此外，在切花菊集约化设施生产中，土壤盐渍化或次生盐渍化会造成植物萎蔫、黄化甚至死亡[3]。菊花产量和品质受到严重影响，经济损失很大。但是，对于盐渍化土壤的改良由于受到自然因素、资金条件的严重限制，效果不明显，且适用范围很有限[3]，因此，培育具有优良抗性性状的菊花新品种是菊花现代育种的重要目标。
盐分胁迫时，植物细胞质膜受损，脂质的过氧化作用加速，胞内活性氧类物质迅速积累，超出细胞的清除能力，因此活性氧积累对细胞造成伤害，维持植物细胞区域化的膜系统被损伤甚至瓦解；活性氧与色氨酸残基或酶蛋白的巯基发生反应导致酶失活；活性氧破坏核酸结构，产生变异并积累；伤害DNA复制过程，蛋白质的合成被破坏[4]。此外，当植物在遭受盐等胁迫，其光合能力降低，光抑制发生，由此碳同化下降，光合电子传递链的过还原，过多的电子会因此而传给分子氧，导致氧气的单价还原或原子排序的异常，从而导致ROS的形成[5]。盐胁迫环境下诱导产生的活性氧引起膜质过氧化，为了减少盐胁迫下细胞的脂质损伤，植物在长期进化中，自身形成了一套活性氧清除系统。活性氧清除系统包括酶促防御系统和非酶促防御系统。酶促防御系统包括SOD、POD、CAT、APX、GR在内，这些保护酶活性的增强能够提高植物的耐盐能力[6]。SOD能够催化O2?转化成H2O2和O2，减轻氧化胁迫对细胞的伤害。非酶促防御系统主要由抗坏血酸AsA，GSH等直接与ROS发生反应。APX及CAT是清除H2O2的主要酶，在抗氧化胁迫过程中发挥着重要作用[7]。
形态解剖结构的变化也使得植物在进化过程中逐渐适应逆境并完成生活史，如表皮毛、乳状突起或腺毛等有利于防止蒸腾和排出盐分[8]。
此外，植物在盐胁迫下，土壤中离子浓度较高，植物细胞内部的水势高于胞外，从而导致细胞缺水。在不断进化的过程中，植物形成了渗透调节的生理机制，以增加细胞溶质浓度，降低胞内水势，维持细胞正常膨压，从而缓解由于脱水胁迫造成的伤害，提高植物的耐盐性[9]。无机渗透调节和有机渗透调节共同参与植物的渗透调节，无机渗透调节主要通过离子的选择性吸收和离子的区域化作用来调节体内的离子稳态，最终形成胞外、胞质、液泡三者之间的离子平衡[10]。但是，无机离子浓度过高会对细胞造成损伤，为了避免细胞质面临液泡和外部环境的双重压迫，因此，植物还会合成有机的亲和渗透调节物质来平衡细胞内外的渗透势，从而酶分子的构象和大分子物质的稳定得到维持[11]。细胞中合成的有机的亲和渗透调节物质主要有：氨基酸及其衍生物（如脯氨酸、甜菜碱等）、低分子糖类（如海藻糖、果聚糖等）、多元醇（如山梨醇、甘露醇等）。
植物热激转录因子（heat stress transcription factors）HSFs是存在于细胞内调节热激蛋白表达的一类转录调节基因，在植物热胁迫信号转导和耐热性的产生过程中发挥重要作用。当植物受到非生物胁迫如高温、干旱、低温和生物胁迫如昆虫取食、病原菌侵染，尤其是热胁迫（heat stress, HS） 时，植物会产生一系列的应激反应，热激转录因子被激活，通过基因活性的调节，对胁迫进行响应。然而在菊花中，关于HSF研究的报道相对较少，开展菊花相关HSF的克隆和功能鉴定对于菊花抗逆性分子机制解析及抗性分子奠定重要基础。
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