梨果实c3’h基因的克隆与分析
摘要：以‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri ‘Dangshansuli’)为试材，进行果肉RNA的提取，反转录成cDNA，通过克隆果实中C3H基因的全长序列，在核苷酸水平上，编码的氨基酸序列由512个氨基酸组成，通过将本研究获得的C3’H编码的氨基酸序列与与苦荞麦（AHA14499.1）、桔梗（AEM63674.1）和毛白杨（AFZ78540.1）编码的C3’H氨基酸序列进行多重比对分析，同源性分别达到75.59%、78.91%和79.88%，系统进化分析发现其与毛白杨等植物的亲缘关系较远，并对其蛋白质二级、三级结构、信号肽、疏水结构域等进行了预测。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料和方法 1
1.1材料 2
1.1.1试材及处理2
1.1.2试剂2
1.2方法 2
1.2.1总RNA的提取和DNA的消化2
1.2.2 cDNA第一链的合成2
1.2.3 梨果实中C3’H基因的的RTPCR扩增2
1.2.4扩增片段的回收与连接 3
1.2.5大肠杆菌感受态细胞的转化及阳性克隆的筛选 3
1.2.6序列比对分析 3
2结果与分析 3
2.1‘砀山酥梨’果实中C3’H基因cDNA的克隆3
2.2蛋白质序列分析 4
2.3分子进化分析 4
2.4 C3’H编码蛋白质的跨膜结构域、疏水性和信号肽序列预测和分析4
2.5 C3’H编码蛋白质的二级结构与三级结构预测和分析4
3讨论 8
致谢8
参考文献9
梨果实C3’H基因的克隆与分析
引言
‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri ‘Dangshansuli’)在我国已有超过500年的栽培历史，分布区域较广，为我国产量第一的梨品种。其果实不仅风味好， 营养价值高，而且有药用价值，深受人们喜爱。近年来由于品
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
种退化和管理不善等因素，‘砀山酥梨’石细胞含量增加，果肉口感粗糙多渣，影响了梨果实的品质[1]。研究表明， 在‘砀山酥梨’的石细胞中，木质素的含量高达29.8％[2]。由于石细胞的形成是木质素在细胞壁沉积的结果，因此其主要成分是木质素[3]。木质素单体的生物合成途径涉及到许多酶的参与，C3’H基因是发现较晚的酶控制基因，在从对香豆酰辅酶 A(pcoumaroyl CoA)到咖啡酰辅酶 A(caffeoyl CoA)的羟基化过程中起作用[4]，是控制木质素H单体与G/S单体相互转化的关键酶。研究发现其在某些植物中存在基因家族现象，研究者已从某些植物中分离得到了C3’H基因[5]。但是关于梨果实中C3’H基因的研究，特别是结合石细胞形成、木质素合成开展的相关研究却未见报道。
本研究以‘砀山酥梨’果实为试材， 通过RTPCR技术克隆获得梨C3’H基因全长， 并对其进行系列分析，为今后探讨C3’H基因在梨果实木质素合成中的作用奠定基础，以期为通过调控石细胞的合成而改良梨果实品质。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试材及处理
试验在江苏省徐州市丰县大沙河镇梨园进行。选择同一果园内树势健壮、管理水平一致，树龄为15年的‘砀山酥梨’(P.bretschneideri CV‘Dangshansuli’)20株，分别在树冠的中层选择花蕾发育期及大小基本一致的枝条挂牌。依据陶书田等[6]的方法对梨果实发育过程中石细胞团发育规律进行研究，从梨盛花期正常授粉后21天至果实膨大期，每隔6天采集1次样品，果实膨大期至果实成熟，分别每隔16、17、15和31天采集1次样品。每次采集果实20个，并于当天用生物冰袋带回实验室，果实清洗去皮并采用四分法将果肉切碎混匀，部分直接用于RNA提取，其余经液氮速冻后于80℃冰箱中保存备用。
1.1.2 试剂
大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α由大学梨工程技术研究中心实验室保存，Rever Tre Ace TM Kit购自TOYOBO TM公司，DNaseⅠ、LA Taq DNA聚合酶、pMD19T载体、dNTPs和DNA marker均购自TaKaRa公司，凝胶回收试剂盒购自Axygen公司，胰蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，PCR引物的合成和测序均由上海英俊生物技术有限公司合成。
1.2方法
1.2.1 总RNA的提取和DNA的消化
采用改良的CTAB法[7]以提取果肉的RNA；用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，利用NanoDrop2000检测浓度，于80℃保存备用。
将提取的总RNA按照如下体系进行DNA消化
（1）配制反应体系：
RNA
1 μg
10×reaction Buffer（Mg2+）
1 μL
DNase I, RNaseFree
1 μL
DEPCtreated water
up to 10 μL
（2）将反应体系放在PCR仪中，37℃30min；
（3）加入1μL50m MEDTA后65℃10min。
1.2.2 cDNA第一链的合成
（1）在消化后的RNA中加入1 μL Oligo(dT)20，65℃ 5 min后置于冰上；
（2）按下表配制反应液
（1）中12 μL变性的RNA
12 μL
5×RT Buffer
2 μL
dNTP(10 mM)
1.2 μL
RRI(10 U/μL)
1.6 μL
Rever Tra Ace
1 μL
将反应体系放入PCR仪中，程序为：30℃ 10 min，42℃ 60 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min。瞬时离心，于20℃保存备用。
1.2.3 梨果实中C3’H基因的RTPCR扩增
根据GenBank上C3’H的保守区域，以及梨基因组调取的C3’H基因序列，利用Primer 5.0设计基因扩增引物。以反转录cDNA为模板，利用正向引物C3’HF（5’→3’）：GGAAGGGTTGTTGGCTGGTA，反向引物C3’HR（5’→3’）：CCAACAGGGAAGG GTTGTGA应用PCR仪对其进行扩增。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料和方法 1
1.1材料 2
1.1.1试材及处理2
1.1.2试剂2
1.2方法 2
1.2.1总RNA的提取和DNA的消化2
1.2.2 cDNA第一链的合成2
1.2.3 梨果实中C3’H基因的的RTPCR扩增2
1.2.4扩增片段的回收与连接 3
1.2.5大肠杆菌感受态细胞的转化及阳性克隆的筛选 3
1.2.6序列比对分析 3
2结果与分析 3
2.1‘砀山酥梨’果实中C3’H基因cDNA的克隆3
2.2蛋白质序列分析 4
2.3分子进化分析 4
2.4 C3’H编码蛋白质的跨膜结构域、疏水性和信号肽序列预测和分析4
2.5 C3’H编码蛋白质的二级结构与三级结构预测和分析4
3讨论 8
致谢8
参考文献9
梨果实C3’H基因的克隆与分析
引言
‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri ‘Dangshansuli’)在我国已有超过500年的栽培历史，分布区域较广，为我国产量第一的梨品种。其果实不仅风味好， 营养价值高，而且有药用价值，深受人们喜爱。近年来由于品
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
种退化和管理不善等因素，‘砀山酥梨’石细胞含量增加，果肉口感粗糙多渣，影响了梨果实的品质[1]。研究表明， 在‘砀山酥梨’的石细胞中，木质素的含量高达29.8％[2]。由于石细胞的形成是木质素在细胞壁沉积的结果，因此其主要成分是木质素[3]。木质素单体的生物合成途径涉及到许多酶的参与，C3’H基因是发现较晚的酶控制基因，在从对香豆酰辅酶 A(pcoumaroyl CoA)到咖啡酰辅酶 A(caffeoyl CoA)的羟基化过程中起作用[4]，是控制木质素H单体与G/S单体相互转化的关键酶。研究发现其在某些植物中存在基因家族现象，研究者已从某些植物中分离得到了C3’H基因[5]。但是关于梨果实中C3’H基因的研究，特别是结合石细胞形成、木质素合成开展的相关研究却未见报道。
本研究以‘砀山酥梨’果实为试材， 通过RTPCR技术克隆获得梨C3’H基因全长， 并对其进行系列分析，为今后探讨C3’H基因在梨果实木质素合成中的作用奠定基础，以期为通过调控石细胞的合成而改良梨果实品质。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试材及处理
试验在江苏省徐州市丰县大沙河镇梨园进行。选择同一果园内树势健壮、管理水平一致，树龄为15年的‘砀山酥梨’(P.bretschneideri CV‘Dangshansuli’)20株，分别在树冠的中层选择花蕾发育期及大小基本一致的枝条挂牌。依据陶书田等[6]的方法对梨果实发育过程中石细胞团发育规律进行研究，从梨盛花期正常授粉后21天至果实膨大期，每隔6天采集1次样品，果实膨大期至果实成熟，分别每隔16、17、15和31天采集1次样品。每次采集果实20个，并于当天用生物冰袋带回实验室，果实清洗去皮并采用四分法将果肉切碎混匀，部分直接用于RNA提取，其余经液氮速冻后于80℃冰箱中保存备用。
1.1.2 试剂
大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α由大学梨工程技术研究中心实验室保存，Rever Tre Ace TM Kit购自TOYOBO TM公司，DNaseⅠ、LA Taq DNA聚合酶、pMD19T载体、dNTPs和DNA marker均购自TaKaRa公司，凝胶回收试剂盒购自Axygen公司，胰蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，PCR引物的合成和测序均由上海英俊生物技术有限公司合成。
1.2方法
1.2.1 总RNA的提取和DNA的消化
采用改良的CTAB法[7]以提取果肉的RNA；用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，利用NanoDrop2000检测浓度，于80℃保存备用。
将提取的总RNA按照如下体系进行DNA消化
（1）配制反应体系：
RNA
1 μg
10×reaction Buffer（Mg2+）
1 μL
DNase I, RNaseFree
1 μL
DEPCtreated water
up to 10 μL
（2）将反应体系放在PCR仪中，37℃30min；
（3）加入1μL50m MEDTA后65℃10min。
1.2.2 cDNA第一链的合成
（1）在消化后的RNA中加入1 μL Oligo(dT)20，65℃ 5 min后置于冰上；
（2）按下表配制反应液
（1）中12 μL变性的RNA
12 μL
5×RT Buffer
2 μL
dNTP(10 mM)
1.2 μL
RRI(10 U/μL)
1.6 μL
Rever Tra Ace
1 μL
将反应体系放入PCR仪中，程序为：30℃ 10 min，42℃ 60 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min。瞬时离心，于20℃保存备用。
1.2.3 梨果实中C3’H基因的RTPCR扩增
根据GenBank上C3’H的保守区域，以及梨基因组调取的C3’H基因序列，利用Primer 5.0设计基因扩增引物。以反转录cDNA为模板，利用正向引物C3’HF（5’→3’）：GGAAGGGTTGTTGGCTGGTA，反向引物C3’HR（5’→3’）：CCAACAGGGAAGG GTTGTGA应用PCR仪对其进行扩增。
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