利用pita和pib基因的功能标记检测抗稻瘟病的种质(附件)
本课题精选出来源于全国各地的436份水稻品种。利用已经发表的稻瘟病广谱抗性基因Pi-ta和Pi-b的功能标记采用PCR分子标记辅助选择的方法结合田间的抗感病表现，2个基因的功能标记与水稻稻瘟病抗感病表现相关性达到极显著水平；在这些供试材料中同时携带两个抗性基因Pi-ta和Pi-b的水稻品种表现为极高的抗性，只携带抗性基因Pi-ta的水稻品种比只携带抗性基因Pi-b的水稻品种对稻瘟病的抗性表现出较高的抗性。只携带抗性基因Pi-b的水稻品种对稻瘟病的抗性表现并不理想；同时发现在这436份水稻品种中，抗性基因Pi-b出现的频率高于抗性基因Pi-ta出现的频率。所以利用对抗性基因Pi-ta和抗性基因Pi-b功能的分子标记可以用来检测不同水稻种质资源对稻瘟病的抗性，从而为抗稻瘟病育种材料的选择奠定了基础。关键词 抗性基因Pi-ta，抗性基因Pi-b，PCR扩增，功能标记
目 录
1 引言 1
1.1 稻瘟病及其症状 1
1.2 功能标记（FMs） 1
1.3 稻瘟病抗性基因Pita和Pib 2
2 供试材料与方法 2
2.1 供试材料 2
2.2 实验仪器与药品 2
2.3 亲本DNA提取 3
2.4 PCR扩增 3
2.5 稻瘟病菌株的接种鉴定 4
3 结果分析 5
3.1 亲本DNA的提取质量 5
3.2 功能标记分析 5
3.3 供试材料DNA的扩增汇总及分析 7
3.4 抗性基因Pita和Pib的标记基因型与436份供试材料田间抗病表现的相关分析 9
3.5 稻瘟病接种鉴定结果分析 10
结论 12
致谢 13
参考文献 14
1 引言
水稻是我国主要粮食作物之一，近年来随着水稻种植面积的扩大和栽培制度的变化，稻瘟病发生的面积也在不断扩大，严重威胁水稻的生产，据调查水稻因稻瘟病每年可导致其减产10%30%，这对水稻的产量造成很大的损失[1]。因此稻瘟病是我国各水稻生产区特待有效抑制的主要病害之一，也成为各育种单位不断攻克的育 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
种目标[2]。稻瘟病阻碍我国大田水稻的高产、稳产、降低水稻品质。所以防治水稻稻瘟病的根本途径在于发掘和利用携带抗性基因的种质资源，培育出适合不同栽培区抗稻瘟病的优质品种资源。因此检测出抗稻瘟病的水稻种质培育抗病品种是控制病害流行最经济、实效且对生物、环境安全的重要途径[3]。
1.1 稻瘟病及其症状
稻瘟病又名稻热病是由子囊菌引起的一种危害水稻生产的病害，是水稻三大主要病害之一[4,5]。叶片、茎秆、稻穗等是稻瘟病主要危害的部位。根据稻瘟病发生部位的不同可将稻瘟病分为苗瘟、叶瘟、穗瘟等。苗瘟：在秧苗三叶期以前发生。病苗茎基部呈灰黑色，上部呈红褐色，最终秧苗干枯卷曲而死。叶瘟：稻株分蘖至拔节期是叶瘟盛发期。最初叶片会出现很小的绿色病斑，以后会逐渐扩大形成不规则的褐色病斑。穗瘟：穗瘟病在发病早期形成褐色小斑点，随后穗颈变褐，造成全穗变白或者变为枯白穗。发病迟则形秕谷。此外，在水稻茎节上、叶枕上发生的稻瘟病则称为节瘟、叶枕瘟[6,7]。稻瘟病具有分布范围广泛、传播速度快、造成损失大等特点。
1.2 功能标记(FMs)
功能标记最早被Andersen等定义为，基于功能基因内部多态性基序引起表型性状变异而开发出来的新型分子标记[8]。其优点是准确性高、筛选速度快、开发成本低、简便实用等特点。随着功能标记技术的不断完善和成熟，通过分子功能标记对紧密连锁的抗稻病基因进行辅助选择，可以加快稻瘟病抗性基因筛选的速度以及鉴定结果，从而让抗性品种的选择效率和品质水平达到一个新高度[9]。同时通过功能标记把抗稻瘟病种质的筛选提到早期，达到提高育种效率和育种的目的性，加快育种进程，从而快速筛选出含有优良抗性基因的种质资源。
1.3 稻瘟病抗性基因Pita和Pib
迄今已被国内外学者精密定位的主效抗稻瘟病基因有80多个，其中已被成功克隆的基因有20个[10,11] 。最早被克隆的2个主效抗性基因分别是 Pita和Pib[12,13]。 Pita在这些主效抗稻瘟病基因中研究最广泛 ，该基因在籼稻中最先被发现，靠近水稻第12染色体着丝点的部位[14,15] 。水稻品种 BL1是抗性基因Pib的起源，它分布在水稻第 2 染色体长臂近末端部位，日本大多数稻瘟病菌生理小种对其具有抗性 [16]。经证实，在水稻生产上抗性基因Pita和 Pib 表现出良好的稻瘟病抗性，并且在稻瘟病抗性育种中成为关注焦点的抗性位点。通过对 Pita 和 Pib这两个基因的功能标记的利用可以有效鉴定出携带这两个稻瘟病抗性基因的种质资源，为进一步育种利用提供理论基础。鉴定抗稻瘟病的常规方法周期长而且容易受到环境条件的影响，刘洋和王忠华等已对广谱稻瘟病抗性基因Pita和Pib进行了测序，设计出可特异性检测这两个抗性基因的功能标记[17,18]。基于前人的研究分析，本研究选用这两个抗性基因的功能标记，对与436份水稻种质资源的DNA序列进行PCR扩增，对扩增产物的多态性进行分析，从而判断其抗感稻瘟病性。PCR克服了常规抗病性鉴定的缺点，产生的信息准确性高，可以快速筛选出携带抗性基因的水稻种质，对抗稻瘟病杂交组合亲本的选配具有重要的指导意义。
2 供试材料与方法
2.1 供试材料
436份水稻供试材料于2016年正季种植于江苏省农业科学院试验田，每品种种植8行，每行12株，行距27cm，株距13cm，常规栽培管理。在分蘖期采集供试材料的鲜嫩叶片，做好记录，保存在20℃条件下的冰箱中备用。
2.2 实验仪器及药品
2.2.1 实验仪器
离心机、通风箱、PCR仪、移液枪、振荡仪、真空仪、琼脂糖凝胶电泳仪、注射器、离心管、粉碎仪、搅拌器、电子秤、烧杯、量筒、紫外线分光光度计、紫外凝胶成像仪、Life Pro基因扩增仪来自杭州博日科技有限公司等。
目 录
1 引言 1
1.1 稻瘟病及其症状 1
1.2 功能标记（FMs） 1
1.3 稻瘟病抗性基因Pita和Pib 2
2 供试材料与方法 2
2.1 供试材料 2
2.2 实验仪器与药品 2
2.3 亲本DNA提取 3
2.4 PCR扩增 3
2.5 稻瘟病菌株的接种鉴定 4
3 结果分析 5
3.1 亲本DNA的提取质量 5
3.2 功能标记分析 5
3.3 供试材料DNA的扩增汇总及分析 7
3.4 抗性基因Pita和Pib的标记基因型与436份供试材料田间抗病表现的相关分析 9
3.5 稻瘟病接种鉴定结果分析 10
结论 12
致谢 13
参考文献 14
1 引言
水稻是我国主要粮食作物之一，近年来随着水稻种植面积的扩大和栽培制度的变化，稻瘟病发生的面积也在不断扩大，严重威胁水稻的生产，据调查水稻因稻瘟病每年可导致其减产10%30%，这对水稻的产量造成很大的损失[1]。因此稻瘟病是我国各水稻生产区特待有效抑制的主要病害之一，也成为各育种单位不断攻克的育 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
种目标[2]。稻瘟病阻碍我国大田水稻的高产、稳产、降低水稻品质。所以防治水稻稻瘟病的根本途径在于发掘和利用携带抗性基因的种质资源，培育出适合不同栽培区抗稻瘟病的优质品种资源。因此检测出抗稻瘟病的水稻种质培育抗病品种是控制病害流行最经济、实效且对生物、环境安全的重要途径[3]。
1.1 稻瘟病及其症状
稻瘟病又名稻热病是由子囊菌引起的一种危害水稻生产的病害，是水稻三大主要病害之一[4,5]。叶片、茎秆、稻穗等是稻瘟病主要危害的部位。根据稻瘟病发生部位的不同可将稻瘟病分为苗瘟、叶瘟、穗瘟等。苗瘟：在秧苗三叶期以前发生。病苗茎基部呈灰黑色，上部呈红褐色，最终秧苗干枯卷曲而死。叶瘟：稻株分蘖至拔节期是叶瘟盛发期。最初叶片会出现很小的绿色病斑，以后会逐渐扩大形成不规则的褐色病斑。穗瘟：穗瘟病在发病早期形成褐色小斑点，随后穗颈变褐，造成全穗变白或者变为枯白穗。发病迟则形秕谷。此外，在水稻茎节上、叶枕上发生的稻瘟病则称为节瘟、叶枕瘟[6,7]。稻瘟病具有分布范围广泛、传播速度快、造成损失大等特点。
1.2 功能标记(FMs)
功能标记最早被Andersen等定义为，基于功能基因内部多态性基序引起表型性状变异而开发出来的新型分子标记[8]。其优点是准确性高、筛选速度快、开发成本低、简便实用等特点。随着功能标记技术的不断完善和成熟，通过分子功能标记对紧密连锁的抗稻病基因进行辅助选择，可以加快稻瘟病抗性基因筛选的速度以及鉴定结果，从而让抗性品种的选择效率和品质水平达到一个新高度[9]。同时通过功能标记把抗稻瘟病种质的筛选提到早期，达到提高育种效率和育种的目的性，加快育种进程，从而快速筛选出含有优良抗性基因的种质资源。
1.3 稻瘟病抗性基因Pita和Pib
迄今已被国内外学者精密定位的主效抗稻瘟病基因有80多个，其中已被成功克隆的基因有20个[10,11] 。最早被克隆的2个主效抗性基因分别是 Pita和Pib[12,13]。 Pita在这些主效抗稻瘟病基因中研究最广泛 ，该基因在籼稻中最先被发现，靠近水稻第12染色体着丝点的部位[14,15] 。水稻品种 BL1是抗性基因Pib的起源，它分布在水稻第 2 染色体长臂近末端部位，日本大多数稻瘟病菌生理小种对其具有抗性 [16]。经证实，在水稻生产上抗性基因Pita和 Pib 表现出良好的稻瘟病抗性，并且在稻瘟病抗性育种中成为关注焦点的抗性位点。通过对 Pita 和 Pib这两个基因的功能标记的利用可以有效鉴定出携带这两个稻瘟病抗性基因的种质资源，为进一步育种利用提供理论基础。鉴定抗稻瘟病的常规方法周期长而且容易受到环境条件的影响，刘洋和王忠华等已对广谱稻瘟病抗性基因Pita和Pib进行了测序，设计出可特异性检测这两个抗性基因的功能标记[17,18]。基于前人的研究分析，本研究选用这两个抗性基因的功能标记，对与436份水稻种质资源的DNA序列进行PCR扩增，对扩增产物的多态性进行分析，从而判断其抗感稻瘟病性。PCR克服了常规抗病性鉴定的缺点，产生的信息准确性高，可以快速筛选出携带抗性基因的水稻种质，对抗稻瘟病杂交组合亲本的选配具有重要的指导意义。
2 供试材料与方法
2.1 供试材料
436份水稻供试材料于2016年正季种植于江苏省农业科学院试验田，每品种种植8行，每行12株，行距27cm，株距13cm，常规栽培管理。在分蘖期采集供试材料的鲜嫩叶片，做好记录，保存在20℃条件下的冰箱中备用。
2.2 实验仪器及药品
2.2.1 实验仪器
离心机、通风箱、PCR仪、移液枪、振荡仪、真空仪、琼脂糖凝胶电泳仪、注射器、离心管、粉碎仪、搅拌器、电子秤、烧杯、量筒、紫外线分光光度计、紫外凝胶成像仪、Life Pro基因扩增仪来自杭州博日科技有限公司等。
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