h2s介导na2seo3抑制不结球白菜根伸长的研究
摘 要：为了研究硒对不结球白菜根伸长的抑制作用和生理机制，本实验以不结球白菜为材料，通过不同浓度的Na2SeO3，处理不结球白菜，观察不结球白菜内源的H2S含量和根长的变化情况。结果表明：随着Na2SeO3浓度的增加，不结球白菜根长生长受抑制程度逐渐增加，不结球白菜根尖内源H2S含量逐渐减少；通过添加外源NaHS能够显著缓解硒对不结球白菜根伸长的抑制作用，而H2S抑制剂对根伸长有显著的抑制作用，且NaHS能够缓解H2S抑制剂对不结球白菜根生长的抑制作用。以上结果表明硒通过降低内源H2S抑制不结球白菜根伸长。
目录
摘 要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引 言 1
1 材料与方法 2
1.1 实验材料 2
1.2 实验试剂 2
1.3 实验仪器 2
1.4 实验方法 2
1.4.1 材料处理 2
1.4.2 指标测定 2
1.5 数据处理 3
2 结果与分析 3
2.1 不同浓度Na2SeO3对不结球白菜根长生长的影响 3
2.2 Na2SeO3处理不同时间对不结球白菜根长的影响 3
2.3 不同浓度Na2SeO3对不结球白菜根尖内源H2S含量影响 4
2.4 不同浓度Na2SeO3处理下不结球白菜根尖内源H2S含量与根长相关分析 4
2.5 外源添加H2S缓解Na2SeO3对不结球白菜根长生长的抑制作用 5
2.6 内源H2S抑制剂和清除剂对Na2SeO3胁迫下不结球白菜根伸长的影响 5
2.7 不同处理H2S供体与抑制剂混合处理对不结球白菜根长的影响 6
3 讨论 6
致 谢 7
参考文献 7
H2S介导Na2SeO3抑制不结球白菜根伸长的研究
引言
引言
不结球白菜（Brassica rapa chinensis）又称青菜、油菜，属于十字花科芸薹属植物，具有栽培简单、口味鲜嫩、营养价值高等特点，另外由于不结球白菜适应性强，可四
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
季栽培，是人们主要食用的绿叶蔬菜。硒（selenium，Se）是一种非金属元素，是人和动物必需的微量元素[1]，微量的硒具有防癌及保护肝脏的作用，硒也是植物必不可少的微量营养素，植物将吸收的无机硒转化为有机硒，可促进植物生长，同时植物中的硒也会直接地影响到人类的硒营养状况[2]。低剂量的硒可以保护植物抵抗不同的环境胁迫，但是超过一定剂量后会对植物造成毒害作用。由于环境中的硒浓度急剧增加，硒正在对环境产生危害，硒污染正在成为全球性的环境安全问题[3]。金属产业的快速发展导致生物化学循环产生的硒被人为地释放到土壤里，导致硒在土壤中富集，并被农作物吸收，从而对农作物产生危害，进而对人类健康造成威胁，如果人体吸收的硒过量，会导致中毒，引起胃肠功能紊乱[4]。研究发现816 mg/L的硒处理能够显著抑制大麦发芽，46 mg/L的硒能够显著抑制豆苗根和芽的生长，还有试验发现即使浓度低至1 mg/L，莴笋和黑麦草的根生长会完全受到抑制[5]。但是硒的毒害作用机理的报道较少，一些研究显示过量的硒能够通过诱导活性氧的产生促发植物的氧化胁迫，继而导致的膜脂过氧化可能使植物产生毒害。Lehotai（2012）的研究显示硒导致的拟南芥根系生长受阻与植物激素和气体信号分子NO有密切关系，但是更深入的植物硒毒性尚不清楚。
H2S是近年发现的继NO和CO之后的第三种内源气体信号分子，研究表明在动物体内H2S以信号分子的形式参与了多种生理活动[6]。作为一种新的信号分子，研究发现NO能够缓解对水稻镉毒害、对小麦镍毒害以及对黄瓜盐胁迫下幼苗生长。H2S是否能够像NO和CO一样缓解逆境胁迫下植物的氧化损伤。作为一种气体信号分子，金竹萍等[7]认为H2S参与了植物生长发育的整个生命过程。外源硫化氢能够缓解水分胁迫下玉米种子的萌发和生长，而且硫化氢供体硫氢化钠处理小麦种子能够提高小麦种子对高温和干旱的抵抗能力[8]。另外硫化氢的检测限制了硫化氢的相关研究。目前硫化氢的研究主要包括微电极或电流传感器检测和检测植物释放的硫化氢气体。而类似于NO荧光探针活体检测植物内源硫化氢的方法还未得到广泛应用。目前已有报道的硫化氢特异性荧光探针有SF1、SF2、SFP1、WSP1等[9]。
本试验为了进一步研究硒对不结球白菜的毒害机理，探讨内源H2S是否参与调节不结球白菜根受到的硒毒害。利用荧光显微镜观察硒胁迫对于植物体内内源H2S的产生的变化情况。为了更深入的了解H2S的作用，还对根伸长等生理学现象进行研究。试验结果有助于解释硒胁迫作用下H2S对植物的调节作用以及硒导致的植物毒性。
1 材料与方法
1.1 实验材料
本实验于2014年8月值至2015年3月在江苏省农业科学院进行。供试不结球白菜品种为南京绿领种业生产的五月慢。
1.2 实验试剂
亚硒酸钠（Na2SeO3，sodium selenite 购自国药集团）
硫氢化钠（NaHS，sodium hydrosulfide 购自sigma公司）
亚牛磺酸（HT，Hypotaurine购自sigma公司）
炔丙基甘氨酸(PAG，lpropargylglycine购自sigma公司)
硫化氢荧光探针WPS1([3′ methoxy 3 oxo 3H spiro[isobenzofuran 1, 9′ xanthen] 6′ yl2 (pyridin 2 yldisulfanyl)benzoate]，由华盛顿大学生化系Prof. Ming Xian惠赠。)
1.3 实验仪器：
AR5120 电子天平(美国 AHOΜS公司)，智能光照培养箱（购自宁波江南仪器厂），荧光显微镜(ECLIPSE， TE2000S，Nikon)，离心机，
1.4 实验方法
1.4.1 材料处理
种子催芽前用1.0% NaClO浸泡消毒10 min，然后用双蒸水冲洗3次，将不结球白菜种子均匀铺在垫有湿润滤纸的培养皿中，在25℃条件下避光催芽24 h。采用营养液培的方法，将萌发一致的种子铺有纱网的浮板上培养，营养液采用1/2 Hoagland营养液[10]，待苗根长长至1 cm左右进行处理，每盆20棵，各浓度分别作3个平行，昼夜培养温度25℃/22℃，相对湿度75%，光照周期14 h/10 h，PH 6.0。
1.4.2 指标测定
根长测定：处理72 h时取样，量取茎基部到根尖的长度作为根长。
内源H2S荧光测定：不结球白菜幼苗根处理72 h后取样，用双蒸水冲洗3次，使用硫化氢荧光探针 (WSP1）进行内源性H2S检测。用20 mmol/L HepesNaOH (PH=7.5) 缓冲液稀释的WSP1硫化氢荧光探针试剂[11]，使其工作浓度为15 μmol/L。于25℃条件下避光孵育40 min，然后用双蒸水漂洗3次，置于荧光显微镜(ECLIPSE, TE2000S，Nikon)下观察并拍照。所拍照片用ImagePro Plus Biological软件统计平均荧光密度。
目录
摘 要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引 言 1
1 材料与方法 2
1.1 实验材料 2
1.2 实验试剂 2
1.3 实验仪器 2
1.4 实验方法 2
1.4.1 材料处理 2
1.4.2 指标测定 2
1.5 数据处理 3
2 结果与分析 3
2.1 不同浓度Na2SeO3对不结球白菜根长生长的影响 3
2.2 Na2SeO3处理不同时间对不结球白菜根长的影响 3
2.3 不同浓度Na2SeO3对不结球白菜根尖内源H2S含量影响 4
2.4 不同浓度Na2SeO3处理下不结球白菜根尖内源H2S含量与根长相关分析 4
2.5 外源添加H2S缓解Na2SeO3对不结球白菜根长生长的抑制作用 5
2.6 内源H2S抑制剂和清除剂对Na2SeO3胁迫下不结球白菜根伸长的影响 5
2.7 不同处理H2S供体与抑制剂混合处理对不结球白菜根长的影响 6
3 讨论 6
致 谢 7
参考文献 7
H2S介导Na2SeO3抑制不结球白菜根伸长的研究
引言
引言
不结球白菜（Brassica rapa chinensis）又称青菜、油菜，属于十字花科芸薹属植物，具有栽培简单、口味鲜嫩、营养价值高等特点，另外由于不结球白菜适应性强，可四
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
季栽培，是人们主要食用的绿叶蔬菜。硒（selenium，Se）是一种非金属元素，是人和动物必需的微量元素[1]，微量的硒具有防癌及保护肝脏的作用，硒也是植物必不可少的微量营养素，植物将吸收的无机硒转化为有机硒，可促进植物生长，同时植物中的硒也会直接地影响到人类的硒营养状况[2]。低剂量的硒可以保护植物抵抗不同的环境胁迫，但是超过一定剂量后会对植物造成毒害作用。由于环境中的硒浓度急剧增加，硒正在对环境产生危害，硒污染正在成为全球性的环境安全问题[3]。金属产业的快速发展导致生物化学循环产生的硒被人为地释放到土壤里，导致硒在土壤中富集，并被农作物吸收，从而对农作物产生危害，进而对人类健康造成威胁，如果人体吸收的硒过量，会导致中毒，引起胃肠功能紊乱[4]。研究发现816 mg/L的硒处理能够显著抑制大麦发芽，46 mg/L的硒能够显著抑制豆苗根和芽的生长，还有试验发现即使浓度低至1 mg/L，莴笋和黑麦草的根生长会完全受到抑制[5]。但是硒的毒害作用机理的报道较少，一些研究显示过量的硒能够通过诱导活性氧的产生促发植物的氧化胁迫，继而导致的膜脂过氧化可能使植物产生毒害。Lehotai（2012）的研究显示硒导致的拟南芥根系生长受阻与植物激素和气体信号分子NO有密切关系，但是更深入的植物硒毒性尚不清楚。
H2S是近年发现的继NO和CO之后的第三种内源气体信号分子，研究表明在动物体内H2S以信号分子的形式参与了多种生理活动[6]。作为一种新的信号分子，研究发现NO能够缓解对水稻镉毒害、对小麦镍毒害以及对黄瓜盐胁迫下幼苗生长。H2S是否能够像NO和CO一样缓解逆境胁迫下植物的氧化损伤。作为一种气体信号分子，金竹萍等[7]认为H2S参与了植物生长发育的整个生命过程。外源硫化氢能够缓解水分胁迫下玉米种子的萌发和生长，而且硫化氢供体硫氢化钠处理小麦种子能够提高小麦种子对高温和干旱的抵抗能力[8]。另外硫化氢的检测限制了硫化氢的相关研究。目前硫化氢的研究主要包括微电极或电流传感器检测和检测植物释放的硫化氢气体。而类似于NO荧光探针活体检测植物内源硫化氢的方法还未得到广泛应用。目前已有报道的硫化氢特异性荧光探针有SF1、SF2、SFP1、WSP1等[9]。
本试验为了进一步研究硒对不结球白菜的毒害机理，探讨内源H2S是否参与调节不结球白菜根受到的硒毒害。利用荧光显微镜观察硒胁迫对于植物体内内源H2S的产生的变化情况。为了更深入的了解H2S的作用，还对根伸长等生理学现象进行研究。试验结果有助于解释硒胁迫作用下H2S对植物的调节作用以及硒导致的植物毒性。
1 材料与方法
1.1 实验材料
本实验于2014年8月值至2015年3月在江苏省农业科学院进行。供试不结球白菜品种为南京绿领种业生产的五月慢。
1.2 实验试剂
亚硒酸钠（Na2SeO3，sodium selenite 购自国药集团）
硫氢化钠（NaHS，sodium hydrosulfide 购自sigma公司）
亚牛磺酸（HT，Hypotaurine购自sigma公司）
炔丙基甘氨酸(PAG，lpropargylglycine购自sigma公司)
硫化氢荧光探针WPS1([3′ methoxy 3 oxo 3H spiro[isobenzofuran 1, 9′ xanthen] 6′ yl2 (pyridin 2 yldisulfanyl)benzoate]，由华盛顿大学生化系Prof. Ming Xian惠赠。)
1.3 实验仪器：
AR5120 电子天平(美国 AHOΜS公司)，智能光照培养箱（购自宁波江南仪器厂），荧光显微镜(ECLIPSE， TE2000S，Nikon)，离心机，
1.4 实验方法
1.4.1 材料处理
种子催芽前用1.0% NaClO浸泡消毒10 min，然后用双蒸水冲洗3次，将不结球白菜种子均匀铺在垫有湿润滤纸的培养皿中，在25℃条件下避光催芽24 h。采用营养液培的方法，将萌发一致的种子铺有纱网的浮板上培养，营养液采用1/2 Hoagland营养液[10]，待苗根长长至1 cm左右进行处理，每盆20棵，各浓度分别作3个平行，昼夜培养温度25℃/22℃，相对湿度75%，光照周期14 h/10 h，PH 6.0。
1.4.2 指标测定
根长测定：处理72 h时取样，量取茎基部到根尖的长度作为根长。
内源H2S荧光测定：不结球白菜幼苗根处理72 h后取样，用双蒸水冲洗3次，使用硫化氢荧光探针 (WSP1）进行内源性H2S检测。用20 mmol/L HepesNaOH (PH=7.5) 缓冲液稀释的WSP1硫化氢荧光探针试剂[11]，使其工作浓度为15 μmol/L。于25℃条件下避光孵育40 min，然后用双蒸水漂洗3次，置于荧光显微镜(ECLIPSE, TE2000S，Nikon)下观察并拍照。所拍照片用ImagePro Plus Biological软件统计平均荧光密度。
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