梨estssr分子标记对梨种质资源多样性鉴定及其在蔷薇科的转移性研究
研究利用来自不同遗传背景的7个梨种质资源对30对基于梨转录组的EST-SSR标记进行初步筛选，得到15对多态性良好的梨EST-SSR标记,共检测到40个等位位点, 利用这15对标记对45份梨种质资源进行遗传多样性研究,可用于区分不同梨品种。聚类分析显示这15对标记将45份梨种质资源在相似系数0.84时分为两大类。利用这15对标记对8个蔷薇科果树物种的96个栽培种进行扩增，结果表明6对梨EST-SSR标记在其他的蔷薇科果树上具有良好的转移性,转移率与亲缘关系相关。筛选的梨EST-SSR标记,可以应用于蔷薇科果树的品种鉴定、遗传多样性分析、图谱比较，也能为蔷薇科的基因组结构和亲缘进化关系研究提供一定的依据。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料和方法 3
1.1 材料 3
1.2 方法 4
1.2.1 植物基因组DNA提取 4
1.2.2 梨属ESTSSR引物合成与筛选 4
1.2.3 扩增产物检测 5
1.2.4 谱带记录与数据分析 5
2 结果与分析 5
2.1 ESTSSR初筛 5
2.2 利用15对梨ESTSSR分析45个梨属植物材料的遗传多样性 6
2.3 梨ESTSSR在蔷薇科果树上的转移性研究 7
3 讨论 8
3.1 梨属ESTSSR标记的应用前景 8
3.2 蔷薇科转移性研究 9
致谢 9
参考文献 9
梨ESTSSR分子标记对梨种质资源多样性鉴定及其在蔷薇科的转移性研究
引言
引言
梨为蔷薇科(Rosaceae)，梨亚科(Maloideae),梨属植物,世界梨属植物约有60余种,分布于欧、亚、北美洲及南半球温带地区。我国目前梨属有18个种,其中原产我国的有13个种[1],而且我国梨的生产总量、栽培面积和出口量均居世界首位[2],其栽培面积和产量仅次于柑橘和苹果,位居第三位,具有重要的经济价值。多年来,研究者从形态学、生物化学、孢粉学和 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
酶学等不同的角度研究了梨属植物的系统关系、品种起源和演化,取得了一定的进展。随着分子生物学技术的快速发展,各种分子标记技术不断出现,大大提高了科研人员对植物进行遗传分析研究的能力,其中以简单重复序列（Simple Sequence Repeat, SSR）标记在植物遗传研究上应用最为广泛。真核基因组中广泛存在着由 1～6 个碱基对组成的简单重复序列,又称为微卫星 DNA。少数原核生物基因组中也有,而且分布比较均匀,每隔 10～50 kb 就存在1个微卫星,其主要以两个核苷酸为重复单位,也有一些微卫星重复单位为3个核苷酸,少数为4个核苷酸或更多,如（CA）n、（GA）n、（GAA）n、（GATA）n 等。SSR 标记因为具有共显性、高度重复性、高度丰富的多态性等优点,成为构建遗传连锁图谱、基因定位、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测、分子标记辅助育种、目标性状分子标记筛选的理想工具。SSR 标记可分为基因组SSR 和ESTSSR,传统的基因组SSR 标记开发不但费时、费力,且开发成本较高[3]。EST 是从随机选择的cDNA 克隆中获得的cDNA 序列片段,代表一个完整基因的一部分[45]。通过搜索含有SSR 的EST 开发SSR 标记是一条快速、有效和廉价的途径。近年来,EST 发展十分迅速,以每周10 000个的速度从大量cDNA 文库中被开发出来[6],因此ESTSSR 标记的开发显得更加简便、快捷,而且ESTSSR标记来自于基因的编码序列,更容易获得基因表达信息,为功能基因的直接鉴定提供了可能。同时,由于ESTSSR 标记来源于相对保守的转录区域,除具有基因组SSR 标记的优点外,还可在近缘物种甚至远缘物种间通用[710],该标记已在苹果[8,1112]、核桃[1314]、猕猴桃[15]、柑橘[16]、香蕉[17]等多种果树中得到了广泛应用。
我国是梨属植物的起源中心之一,蕴藏着丰富的种质资源,主要分为白梨、秋子梨、砂梨、新疆梨、野生梨等几大类,起源于中国的梨约有 13个种,其中野生种分布广泛,栽培种呈区域分布。南方分布着‘砂梨’、华北分布着‘白梨’、东北是‘秋子梨’的发源地,而西北分布着‘新疆梨’。梨还是中国果树栽培分布最广的树种之一,东起黄海之滨、西至天山南北；南起两广云贵、北到宁蒙吉黑,到处都有梨树的栽培。梨树在我国栽培历史悠久,种质资源十分丰富但许多品种资源的分类地位及亲缘关系尚不清楚,不利于进一步利用现有资源展育种工作。目前有关梨ESTSSR标记的开发和应用研究较少,在一定程度上影响了对现有梨种质资源的评价和利用。Yamamoto等曾利用来自苹果的SSR标记分析梨的遗传多样性,并通过Southern杂交和测序验证发现苹果SSR位点两侧的序列在梨上是高度保守的,说明从苹果上开发的SSR标记完全可以应用于梨属的遗传研究中[18,19]；姚利华基于苹果属EST库开发了40对ESTSSR标记,并检测了少数引物在梨属植物上的多态性,但涉及品种资源较少,进一步的研究尚未开展[21]。关于一些重要的梨种的系统分类还存在较大争议,因此利用梨ESTSSR来研究梨种质资源有着非常重要的意义,本实验利用新开发的梨ESTSSR来评价45个梨基因型的遗传多样性,具有非常重要的意义。
蔷薇科中的许多种如苹果、海棠、梨、桃、李、杏、梅、樱桃、枇杷、山楂、草莓等 ,是著名的水果；扁桃仁和杏仁是著名的干果,但除了已测序完成的梨、苹果、草莓外,很多物种的遗传信息较少,这无疑阻碍了对这些物种的遗传机制的进一步深入研究。因此,本研究利用最新的梨EST库数据资源开发ESTSSR标记来研究梨的遗传多样性,不仅对于梨品种的鉴定与多态性分析,遗传连锁图谱的构建、比较作图和分子系统发育等研究领域具有重要应用价值；此外,梨ESTSSR良好的转移性可以大大降低其他蔷薇科果树ESTSSR的开发成本,应用于梨和其他蔷薇科果树的品种鉴定、遗传多样性分析、图谱比较,也能为蔷薇科的基因组结构和亲缘进化关系研究提供一定的依据。
1 材料和方法
1.1 材料
7个初筛梨品种：‘考密斯’、‘丰水’、‘火把梨’、‘库尔勒香梨’、‘豆梨’、‘鸭梨’、‘京白梨’。其中，‘考密斯’是西洋梨品种，‘丰水’是砂梨品种，‘火把梨’是云南的半野生半栽培种，‘库尔勒香梨’是新疆梨品种，‘豆梨’是常用的梨砧木，‘鸭梨’是白梨品种，‘京白梨’是秋子梨品种。45个梨属植物材料均采自大学江浦农场资源圃，编号、样品名称见表1。8个蔷薇科果树的96个栽培种的信息及来源地见表2，其中果梅叶片采集于南京市溧水傅家边科技观光园的果梅种质资源圃，桃、李、杏、樱桃、苹果的叶片采于山东省果树研究所果树苗圃示范基地,草莓的叶片采于山东农业大学温室,枇杷的样品采于苏州大学白沙枇杷种质资源圃。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料和方法 3
1.1 材料 3
1.2 方法 4
1.2.1 植物基因组DNA提取 4
1.2.2 梨属ESTSSR引物合成与筛选 4
1.2.3 扩增产物检测 5
1.2.4 谱带记录与数据分析 5
2 结果与分析 5
2.1 ESTSSR初筛 5
2.2 利用15对梨ESTSSR分析45个梨属植物材料的遗传多样性 6
2.3 梨ESTSSR在蔷薇科果树上的转移性研究 7
3 讨论 8
3.1 梨属ESTSSR标记的应用前景 8
3.2 蔷薇科转移性研究 9
致谢 9
参考文献 9
梨ESTSSR分子标记对梨种质资源多样性鉴定及其在蔷薇科的转移性研究
引言
引言
梨为蔷薇科(Rosaceae)，梨亚科(Maloideae),梨属植物,世界梨属植物约有60余种,分布于欧、亚、北美洲及南半球温带地区。我国目前梨属有18个种,其中原产我国的有13个种[1],而且我国梨的生产总量、栽培面积和出口量均居世界首位[2],其栽培面积和产量仅次于柑橘和苹果,位居第三位,具有重要的经济价值。多年来,研究者从形态学、生物化学、孢粉学和 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
酶学等不同的角度研究了梨属植物的系统关系、品种起源和演化,取得了一定的进展。随着分子生物学技术的快速发展,各种分子标记技术不断出现,大大提高了科研人员对植物进行遗传分析研究的能力,其中以简单重复序列（Simple Sequence Repeat, SSR）标记在植物遗传研究上应用最为广泛。真核基因组中广泛存在着由 1～6 个碱基对组成的简单重复序列,又称为微卫星 DNA。少数原核生物基因组中也有,而且分布比较均匀,每隔 10～50 kb 就存在1个微卫星,其主要以两个核苷酸为重复单位,也有一些微卫星重复单位为3个核苷酸,少数为4个核苷酸或更多,如（CA）n、（GA）n、（GAA）n、（GATA）n 等。SSR 标记因为具有共显性、高度重复性、高度丰富的多态性等优点,成为构建遗传连锁图谱、基因定位、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测、分子标记辅助育种、目标性状分子标记筛选的理想工具。SSR 标记可分为基因组SSR 和ESTSSR,传统的基因组SSR 标记开发不但费时、费力,且开发成本较高[3]。EST 是从随机选择的cDNA 克隆中获得的cDNA 序列片段,代表一个完整基因的一部分[45]。通过搜索含有SSR 的EST 开发SSR 标记是一条快速、有效和廉价的途径。近年来,EST 发展十分迅速,以每周10 000个的速度从大量cDNA 文库中被开发出来[6],因此ESTSSR 标记的开发显得更加简便、快捷,而且ESTSSR标记来自于基因的编码序列,更容易获得基因表达信息,为功能基因的直接鉴定提供了可能。同时,由于ESTSSR 标记来源于相对保守的转录区域,除具有基因组SSR 标记的优点外,还可在近缘物种甚至远缘物种间通用[710],该标记已在苹果[8,1112]、核桃[1314]、猕猴桃[15]、柑橘[16]、香蕉[17]等多种果树中得到了广泛应用。
我国是梨属植物的起源中心之一,蕴藏着丰富的种质资源,主要分为白梨、秋子梨、砂梨、新疆梨、野生梨等几大类,起源于中国的梨约有 13个种,其中野生种分布广泛,栽培种呈区域分布。南方分布着‘砂梨’、华北分布着‘白梨’、东北是‘秋子梨’的发源地,而西北分布着‘新疆梨’。梨还是中国果树栽培分布最广的树种之一,东起黄海之滨、西至天山南北；南起两广云贵、北到宁蒙吉黑,到处都有梨树的栽培。梨树在我国栽培历史悠久,种质资源十分丰富但许多品种资源的分类地位及亲缘关系尚不清楚,不利于进一步利用现有资源展育种工作。目前有关梨ESTSSR标记的开发和应用研究较少,在一定程度上影响了对现有梨种质资源的评价和利用。Yamamoto等曾利用来自苹果的SSR标记分析梨的遗传多样性,并通过Southern杂交和测序验证发现苹果SSR位点两侧的序列在梨上是高度保守的,说明从苹果上开发的SSR标记完全可以应用于梨属的遗传研究中[18,19]；姚利华基于苹果属EST库开发了40对ESTSSR标记,并检测了少数引物在梨属植物上的多态性,但涉及品种资源较少,进一步的研究尚未开展[21]。关于一些重要的梨种的系统分类还存在较大争议,因此利用梨ESTSSR来研究梨种质资源有着非常重要的意义,本实验利用新开发的梨ESTSSR来评价45个梨基因型的遗传多样性,具有非常重要的意义。
蔷薇科中的许多种如苹果、海棠、梨、桃、李、杏、梅、樱桃、枇杷、山楂、草莓等 ,是著名的水果；扁桃仁和杏仁是著名的干果,但除了已测序完成的梨、苹果、草莓外,很多物种的遗传信息较少,这无疑阻碍了对这些物种的遗传机制的进一步深入研究。因此,本研究利用最新的梨EST库数据资源开发ESTSSR标记来研究梨的遗传多样性,不仅对于梨品种的鉴定与多态性分析,遗传连锁图谱的构建、比较作图和分子系统发育等研究领域具有重要应用价值；此外,梨ESTSSR良好的转移性可以大大降低其他蔷薇科果树ESTSSR的开发成本,应用于梨和其他蔷薇科果树的品种鉴定、遗传多样性分析、图谱比较,也能为蔷薇科的基因组结构和亲缘进化关系研究提供一定的依据。
1 材料和方法
1.1 材料
7个初筛梨品种：‘考密斯’、‘丰水’、‘火把梨’、‘库尔勒香梨’、‘豆梨’、‘鸭梨’、‘京白梨’。其中，‘考密斯’是西洋梨品种，‘丰水’是砂梨品种，‘火把梨’是云南的半野生半栽培种，‘库尔勒香梨’是新疆梨品种，‘豆梨’是常用的梨砧木，‘鸭梨’是白梨品种，‘京白梨’是秋子梨品种。45个梨属植物材料均采自大学江浦农场资源圃，编号、样品名称见表1。8个蔷薇科果树的96个栽培种的信息及来源地见表2，其中果梅叶片采集于南京市溧水傅家边科技观光园的果梅种质资源圃，桃、李、杏、樱桃、苹果的叶片采于山东省果树研究所果树苗圃示范基地,草莓的叶片采于山东农业大学温室,枇杷的样品采于苏州大学白沙枇杷种质资源圃。
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