不同凹土条件下土壤酞酸酯生态毒理效应的响应
目 录
1 引言 1
1.1 酞酸酯概述 1
1.1.1 酞酸酯类污染现状 1
1.1.2 酞酸酯类物质的危害 1
1.2 蚯蚓在土壤生态毒理中的意义 2
1.2.1 细胞色素P450酶 2
1.3 凹土的性质及作用 3
1.4 研究意义 4
2 材料与方法 4
2.1 实验材料 4
2.1.1 试验仪器和试剂 4
2.2试验设计 5
2.3蛋白质含量的测定 5
2.3.2样本前处理 5
2.3.3蛋白质含量测定方法及公式 5
2.4 细胞色素P450酶含量测定 6
2.4.1细胞色素P450酶含量测定方法及公式 6
2.5 数据分析 6
3 结果与讨论 6
3.1凹土对DEHP和DBP（50mg kg-1）下的蚯蚓蛋白质浓度的影响 6
3.2凹土对DEHP和DBP（50mg kg-1）下的蚯蚓细胞色素P450酶含量的影响 8
3.3 凹土对DEHP和DBP（500mg kg-1）下的蚯蚓蛋白质浓度的影响 9
3.4 凹土对DEHP和DBP（500mg kg-1）下的蚯蚓细胞色素P450酶系的影响 10
结 论 13
参 考 文 献 14
致 谢 16
1 引言
随着时代的快速发展，酞酸酯类物质已被广泛应用于农业（塑料膜、农药、肥料等等），化妆品及儿童玩具等等行业。其是一类毒性较大的有机化合物，具有持久性、生物蓄积性、长距离迁移性等特性，可以在食物链中进行转移与富集，从而造成水体、 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
空气及土壤污染。导致人们赖以生存的环境遭到严重的破坏，对人类的生存造成严重的威胁。酞酸酯类进入体内是很难排出，长期积累会刺激人体内分泌系统，另外具有致突变性，致畸性和致癌性的三性特性。近年来，酞酸酯类污染物已受到越来越多人的关注，已成为全球性环境研究的热点。本实验以蚯蚓为供试验生物，以细胞色素P450总含量为指标，模拟辣椒生长环境土添加不同浓度DBP、DEHP及在这些浓度下再添加不同浓度的凹土。检测出凹土对降低酞酸酯类物质对蚯蚓细胞色素的影响，为以后环境修复做出早期诊断与预测。
1.1 酞酸酯概述
1.1.1 酞酸酯类污染现状
根据不完全统计全球酞酸酯类物质每年的使用量820吨之多，其中有超过1%的酞酸酯进入了环境中了，对人们的生活环境造成了极大的影响。随着人们对生活环境意识的不断加强，酞酸酯类污染问题已得到越来越多的人的重视，被人们称之为“第二个全球性PCB污染”[1]。
环境中的酞酸酯主要是由于人类的活动造成的，常见的有6中，分别是邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）、邻苯二甲酸丁基苄基酯（BBP）、邻苯二甲酸二(2 -乙基己基酯)（DEHP）、邻苯二甲酸二异辛酯（DOP）这些都被美国环保局标为外优先测试的有毒物质污染物。而在中国将邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二异辛酯（DOP）这三种酞酸酯类标记为优先检测的污染物。本试验主要是测其中的两种，即DBP、DEHP。
1.1.2 酞酸酯类物质的危害
酞酸酯主要是呈现无色的粘稠状的液体，常温度下，不易挥发，而且难溶于水。酞酸酯类急性毒性不大，但大浓度下毒性大了。主要是刺激内分泌系统，对生殖和发育、神经系统毒性以及免疫系统都有很大的影响[2]。由于过去人们对酞酸酯类物质的毒性不是太过了解，一直以为其毒性较低。才导致越来越多的酞酸酯类被用于各行各业中，由于回收处理不当或其他一些原因最终通过不同途径进入土壤、空气中对环境造成了不可估量的污染，常见的领域主要是在农业方面：农药、肥料，化妆品、儿童的玩具等等。
如长期使用含有酞酸酯的化妆品，尤其是有的化妆品含有过多的酞酸酯，这也使得酞酸酯类会通过这些直接进入人体，由于其不能够很好地排出，从而在人体内不断的积累，如果过多的使用，会导致孕妇流产或产出的婴儿大多是畸性的。根据调查，人体内残留过高是会发挥出类似雌性激素的作用，从而影响雄性激素的分泌，使男性精液量和精子数量减少等等[3]。从而造成不可磨灭的伤害。
另外由于酞酸酯的特殊的性质，所以在医用方面也是较为广泛使用的。像人工心脏瓣膜、血管移植材料、医用贮血袋材料等等都含有一定的酞酸酯。血袋上的增塑剂极容易溶入血液中，根据调查显示，血浆用这种贮血袋冷藏保存21天后，DEHP的含量就会高达50%~70%之多，患者在不知情的情况下输入了这种血浆就会加大患者出现呼吸困难、肺原体休克等现象，严重的会造成患者死亡。据寺师朗子等的报告中，DEHP以2.5%添加到饲料中，连续喂料3个星期。就会引起动物肝肥大，肝或肾尿细管上皮细胞的浑浊变性与环死，形成肾囊胞样结节。酞酸酯的特殊毒性主要是致畸性、致癌、致突变性[4]。邱东茹[5]等指出DEHP对小鼠、大鼠、鸽子、兔子、鸡经口致死量为1g/kg~31g/kg。静脉注射0.07g/kg~0.3g/kg可引起死亡。对大鼠腹腔注射DEHP致死量为5g/kg~30g/kg，大白兔、大鼠和豚鼠皮肤接触未经稀释的DEHP可发现有轻微或中等程度的刺激反应。
1.2 蚯蚓在土壤生态毒理中的意义
蚯蚓是属于全期土壤动物，土壤总生物量中占量最多的生物，其次蚯蚓主要是以土壤中的真菌，原生动物等为主要食物来源的，是生态系统的一个重要组成部分。因此，极易通过表皮和口两个途径接触污染土壤，使蚯蚓可以直接暴露于土壤污染物中，对受污染的土壤敏感性良好。所以对蚯蚓体内的污染物含量检测可以更加客观的体现出该地区污染程度。目前，蚯蚓生物标记物主要集中在生物大分子水平研究上，像蚯蚓体内解毒酶系，解毒蛋白和体腔细胞溶酶体膜稳定性的研究。
蚯蚓作为生态毒理检测的标志生物，目前已有一套较为完善的标准的试验方法，例如国际标准组织等对蚯蚓的急性毒性、亚急性毒性、慢性毒性试验和再生试验方法做了详细的标准化规则[6]。
1.2.1 细胞色素P450酶
随着人们对土壤污染毒理的不断地探讨与研究，发现以土壤生物急性致死率等毒理指标来作为实验最终的研究已经越来越不能够满足在污染条件下毒理诊断的需要，以细胞色素P450酶系作为生物标记物的研究却很少有成功的报道[10]。
细胞色素P450的研究已有数十年的历史了，它是生物体内含有多种细胞色素P450血红素蛋白或相同结构域的一系列酶，它的一系列反应的发生是接受了电子传递酶传递来的电子而发生的，除底物外，还受其他一些因素影响[11]。研究发现，P450酶主要表现有：激活、自身激活、底物抑制、部分抑制、两相动力学及差异动力学等等特性[12]。细胞色素3A4在人类的肝脏的各种P450酶中，其含量都是很高的，占人肝的0.5%[13-15]。目前，大多的研究都是集中在以水生生物肝脏为靶器官，进行细胞色素P450含量或P4501A1族酶活性与水体污染物的诱导关系的研究[16-17]。之前有人利用实验鼠对其口服多环芳烃污染土壤的方式来起到中毒，进行土壤污染程度与鼠肝微粒体P450含量诱导关系进行研究[18]。参照鼠肝微粒体细胞色素P450含量测定的方法基础上，以国际标准方法组织推荐的土壤动物蚯蚓为实验动物，因为蚯蚓没有类似于水生生物那样的肝脏用于研究，所以以蚯蚓细胞色素P450酶系活性来研究。本次试验就是使用太平2号（红蚯蚓），太平二号蚯蚓价格实惠又易于饲养,且因蚯蚓种的生活周期短，繁殖能力强，现已被公认成为最广泛的模式供试物种。蚯蚓是属于全期土壤动物，约占土壤总生物量的60%~80%[19-20]，其次蚯蚓主要是以土壤中的真菌，原生动物等为主要食物来源的，是生态系统的一个重要组成部分。因而进入土壤中的污染物质可以通过食物链转移在蚯蚓体内富集，所以对蚯蚓体内的污染物含量检测可以更加客观的体现出该地区污染程度，对蚯蚓细胞色素P450活性的测定可以测出蚯蚓暴露在酞酸酯类下的生化响应。
1 引言 1
1.1 酞酸酯概述 1
1.1.1 酞酸酯类污染现状 1
1.1.2 酞酸酯类物质的危害 1
1.2 蚯蚓在土壤生态毒理中的意义 2
1.2.1 细胞色素P450酶 2
1.3 凹土的性质及作用 3
1.4 研究意义 4
2 材料与方法 4
2.1 实验材料 4
2.1.1 试验仪器和试剂 4
2.2试验设计 5
2.3蛋白质含量的测定 5
2.3.2样本前处理 5
2.3.3蛋白质含量测定方法及公式 5
2.4 细胞色素P450酶含量测定 6
2.4.1细胞色素P450酶含量测定方法及公式 6
2.5 数据分析 6
3 结果与讨论 6
3.1凹土对DEHP和DBP（50mg kg-1）下的蚯蚓蛋白质浓度的影响 6
3.2凹土对DEHP和DBP（50mg kg-1）下的蚯蚓细胞色素P450酶含量的影响 8
3.3 凹土对DEHP和DBP（500mg kg-1）下的蚯蚓蛋白质浓度的影响 9
3.4 凹土对DEHP和DBP（500mg kg-1）下的蚯蚓细胞色素P450酶系的影响 10
结 论 13
参 考 文 献 14
致 谢 16
1 引言
随着时代的快速发展，酞酸酯类物质已被广泛应用于农业（塑料膜、农药、肥料等等），化妆品及儿童玩具等等行业。其是一类毒性较大的有机化合物，具有持久性、生物蓄积性、长距离迁移性等特性，可以在食物链中进行转移与富集，从而造成水体、 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
空气及土壤污染。导致人们赖以生存的环境遭到严重的破坏，对人类的生存造成严重的威胁。酞酸酯类进入体内是很难排出，长期积累会刺激人体内分泌系统，另外具有致突变性，致畸性和致癌性的三性特性。近年来，酞酸酯类污染物已受到越来越多人的关注，已成为全球性环境研究的热点。本实验以蚯蚓为供试验生物，以细胞色素P450总含量为指标，模拟辣椒生长环境土添加不同浓度DBP、DEHP及在这些浓度下再添加不同浓度的凹土。检测出凹土对降低酞酸酯类物质对蚯蚓细胞色素的影响，为以后环境修复做出早期诊断与预测。
1.1 酞酸酯概述
1.1.1 酞酸酯类污染现状
根据不完全统计全球酞酸酯类物质每年的使用量820吨之多，其中有超过1%的酞酸酯进入了环境中了，对人们的生活环境造成了极大的影响。随着人们对生活环境意识的不断加强，酞酸酯类污染问题已得到越来越多的人的重视，被人们称之为“第二个全球性PCB污染”[1]。
环境中的酞酸酯主要是由于人类的活动造成的，常见的有6中，分别是邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）、邻苯二甲酸丁基苄基酯（BBP）、邻苯二甲酸二(2 -乙基己基酯)（DEHP）、邻苯二甲酸二异辛酯（DOP）这些都被美国环保局标为外优先测试的有毒物质污染物。而在中国将邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二异辛酯（DOP）这三种酞酸酯类标记为优先检测的污染物。本试验主要是测其中的两种，即DBP、DEHP。
1.1.2 酞酸酯类物质的危害
酞酸酯主要是呈现无色的粘稠状的液体，常温度下，不易挥发，而且难溶于水。酞酸酯类急性毒性不大，但大浓度下毒性大了。主要是刺激内分泌系统，对生殖和发育、神经系统毒性以及免疫系统都有很大的影响[2]。由于过去人们对酞酸酯类物质的毒性不是太过了解，一直以为其毒性较低。才导致越来越多的酞酸酯类被用于各行各业中，由于回收处理不当或其他一些原因最终通过不同途径进入土壤、空气中对环境造成了不可估量的污染，常见的领域主要是在农业方面：农药、肥料，化妆品、儿童的玩具等等。
如长期使用含有酞酸酯的化妆品，尤其是有的化妆品含有过多的酞酸酯，这也使得酞酸酯类会通过这些直接进入人体，由于其不能够很好地排出，从而在人体内不断的积累，如果过多的使用，会导致孕妇流产或产出的婴儿大多是畸性的。根据调查，人体内残留过高是会发挥出类似雌性激素的作用，从而影响雄性激素的分泌，使男性精液量和精子数量减少等等[3]。从而造成不可磨灭的伤害。
另外由于酞酸酯的特殊的性质，所以在医用方面也是较为广泛使用的。像人工心脏瓣膜、血管移植材料、医用贮血袋材料等等都含有一定的酞酸酯。血袋上的增塑剂极容易溶入血液中，根据调查显示，血浆用这种贮血袋冷藏保存21天后，DEHP的含量就会高达50%~70%之多，患者在不知情的情况下输入了这种血浆就会加大患者出现呼吸困难、肺原体休克等现象，严重的会造成患者死亡。据寺师朗子等的报告中，DEHP以2.5%添加到饲料中，连续喂料3个星期。就会引起动物肝肥大，肝或肾尿细管上皮细胞的浑浊变性与环死，形成肾囊胞样结节。酞酸酯的特殊毒性主要是致畸性、致癌、致突变性[4]。邱东茹[5]等指出DEHP对小鼠、大鼠、鸽子、兔子、鸡经口致死量为1g/kg~31g/kg。静脉注射0.07g/kg~0.3g/kg可引起死亡。对大鼠腹腔注射DEHP致死量为5g/kg~30g/kg，大白兔、大鼠和豚鼠皮肤接触未经稀释的DEHP可发现有轻微或中等程度的刺激反应。
1.2 蚯蚓在土壤生态毒理中的意义
蚯蚓是属于全期土壤动物，土壤总生物量中占量最多的生物，其次蚯蚓主要是以土壤中的真菌，原生动物等为主要食物来源的，是生态系统的一个重要组成部分。因此，极易通过表皮和口两个途径接触污染土壤，使蚯蚓可以直接暴露于土壤污染物中，对受污染的土壤敏感性良好。所以对蚯蚓体内的污染物含量检测可以更加客观的体现出该地区污染程度。目前，蚯蚓生物标记物主要集中在生物大分子水平研究上，像蚯蚓体内解毒酶系，解毒蛋白和体腔细胞溶酶体膜稳定性的研究。
蚯蚓作为生态毒理检测的标志生物，目前已有一套较为完善的标准的试验方法，例如国际标准组织等对蚯蚓的急性毒性、亚急性毒性、慢性毒性试验和再生试验方法做了详细的标准化规则[6]。
1.2.1 细胞色素P450酶
随着人们对土壤污染毒理的不断地探讨与研究，发现以土壤生物急性致死率等毒理指标来作为实验最终的研究已经越来越不能够满足在污染条件下毒理诊断的需要，以细胞色素P450酶系作为生物标记物的研究却很少有成功的报道[10]。
细胞色素P450的研究已有数十年的历史了，它是生物体内含有多种细胞色素P450血红素蛋白或相同结构域的一系列酶，它的一系列反应的发生是接受了电子传递酶传递来的电子而发生的，除底物外，还受其他一些因素影响[11]。研究发现，P450酶主要表现有：激活、自身激活、底物抑制、部分抑制、两相动力学及差异动力学等等特性[12]。细胞色素3A4在人类的肝脏的各种P450酶中，其含量都是很高的，占人肝的0.5%[13-15]。目前，大多的研究都是集中在以水生生物肝脏为靶器官，进行细胞色素P450含量或P4501A1族酶活性与水体污染物的诱导关系的研究[16-17]。之前有人利用实验鼠对其口服多环芳烃污染土壤的方式来起到中毒，进行土壤污染程度与鼠肝微粒体P450含量诱导关系进行研究[18]。参照鼠肝微粒体细胞色素P450含量测定的方法基础上，以国际标准方法组织推荐的土壤动物蚯蚓为实验动物，因为蚯蚓没有类似于水生生物那样的肝脏用于研究，所以以蚯蚓细胞色素P450酶系活性来研究。本次试验就是使用太平2号（红蚯蚓），太平二号蚯蚓价格实惠又易于饲养,且因蚯蚓种的生活周期短，繁殖能力强，现已被公认成为最广泛的模式供试物种。蚯蚓是属于全期土壤动物，约占土壤总生物量的60%~80%[19-20]，其次蚯蚓主要是以土壤中的真菌，原生动物等为主要食物来源的，是生态系统的一个重要组成部分。因而进入土壤中的污染物质可以通过食物链转移在蚯蚓体内富集，所以对蚯蚓体内的污染物含量检测可以更加客观的体现出该地区污染程度，对蚯蚓细胞色素P450活性的测定可以测出蚯蚓暴露在酞酸酯类下的生化响应。
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