秋水仙素诱导野生草莓杂交后代染色体加倍
摘 要本实验以绿色草莓(F.viridis)为母本和东北草莓(F. mandschurica)为父本的种间杂种后代的茎尖为外植体，在获得组培苗的基础上探索最佳增殖培养的配方，结果表明MS培养基添加1.0 mg/L的NAA及0.1 mg/L的6-BA最有利于茎尖的快速生长；以秋水仙素为诱导剂对茎尖进行多倍体诱导，研究不同浓度的秋水仙素0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%在不同处理时间24 h、36 h、48 h、60 h下诱导的效果，结果显示当秋水仙素浓度为0.20%，处理时长为48 h时，诱导出较多的嵌合体，未获得四倍体植株。
目录
摘 要1
引 言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料2
1.2 初代培养2
1.3 适合二倍体种间杂种的培养基2
1.4 二倍体种间杂种的离体加倍 3
1.5 诱导后的检测 4
2 结果与分析4
2.1 适宜草莓茎尖增殖的6BA浓度4
2.2 流式细胞仪检测种间杂种4
3 讨论8
3.1 秋水仙素诱导部位的选择 8
3.2 秋水仙素溶液的处理条件及特点8
3.3 四倍体诱导失败原因分析8
参考文献10
图 版11
致 谢13
秋水仙素诱导野生草莓杂交后代染色体加倍
引言
引言
从1937年Kreisler等人用秋水仙素处理曼陀罗获得多倍体开始，半个世纪以来，果树育种学家对多种果树进行了多倍体诱导的研究。到目前为止，已在梨、苹果、葡萄、草莓、柑橘、枣、猕猴桃、核桃等树种上成功诱导出多倍体植株[1]。多倍体植物由于染色体加倍，其外部形态特征和二倍体有明显的差别，主要表现在根、茎、叶的形态和大小上[2]。植物多倍化不仅使植株基因活性及酶的差异性增强，而且还增强了植株的生态适应性、对逆境的抗耐性以及降低了蒸腾作用，提高了光合效率等[3]。
草莓是蔷薇科草莓属（Fragaria）多年生草本植物。中国是世界上野生草莓资源最丰富的国家，长白山山脉、大兴安岭蕴藏着种类和数量极为丰富的野生草莓[4] *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
。野生草莓在提高栽培品种抗逆性、抗病性、芳香性、固形物含量等方面有较大潜力，因此国外很多学者进行了草莓种间杂交以获得新类型新品种[5,6]。但是，国内外有关草莓多倍体诱导的研究报道不多。Hull用秋水仙碱处理草莓杂种栽培品种Missionory Premier与智利草莓（F.chiloensis）杂交获得的杂种萌发种子得到16x加倍植株[7]，雷家军等用秋水仙碱处理草莓茎尖获得加倍植株[8]，但是以种子、茎尖为诱变材料，容易出现嵌合体。叶片离体再生的不定芽起源于单细胞[9]，在叶片离体再生过程中进行秋水仙碱处理，能够有效地获得同质突变体，这已在苹果[10]等植物上获得成功。我国研究人员大多用东北草莓(F. mandschurica)与凤梨草莓(Fragaria ananassa)或黄毛草莓（F.nilgerrensis）杂交，随后进行加倍处理[11]，本实验利用秋水仙素诱导绿色草莓(F.viridis)与东北草莓杂种染色体加倍尚属首次。
秋水仙素是微管特异性药物[12]，由于适宜浓度的秋水仙素，能破坏纺锤丝的形成，因此可使分生细胞复制的染色体在细胞分裂时不能分向两极，从而导致新生细胞的染色体加倍[7]。用秋水仙素诱导多倍体时，通常是用秋水仙素溶液浸泡或点滴处理分生组织，从而获得多倍体，所用浓度一般在0.01%0.4%[13]之间。离体组织细胞染色体加倍也以其容易控制实验条件和重复实验结果，提高工作效率，减少嵌合体等优势而逐渐受到重视。利用该法通过调整亲本的倍性，对克服远缘杂交的不孕性、远缘杂交的不实性、创造远缘杂交育种的中间亲本及培育作物新品种等方面具有积极的作用[14]。
染色体倍性鉴定方法最常用的是染色体数目鉴定法[15,16]。流式细胞仪(flow cytometer，FCM)也称倍性分析仪(ploidy analyzer)，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是比较先进的检测仪器。它可定量地测定某一细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同细胞的数量，近年来得到越来越广泛的应用。特别在植物育种方面，采用流式细胞仪可快速准确地鉴定各种植物的倍性，从而提高育种工作效率[17]。流式细胞仪鉴定植物倍性的原理为细胞DNA染色，每个细胞以均等时间依次通过测量区，经荧光染料染色的细胞受到激光照射后即发出荧光，由于DNA含量与荧光信号强度成正比关系，细胞发出的荧光信号强度可代表所测细胞核内的DNA含量，因而可用于植物倍性鉴定[18]。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料保存于大学牌楼草莓种质基地，是由绿色草莓为母本，东北草莓为父本杂交获得的杂种，共3个株系，统一编号为LsDb1101、LsDb1102、LsDb1103。
1.2 初代培养
剪取长约1.5～2.0 cm的田间匍匐茎茎尖为外植体，保湿带回实验室；
自来水流水冲洗4~6 h；
在超净工作台上依次用70 %乙醇消毒40 s、0.1 %升汞消毒8 min，无菌水冲洗4~ 5次，接种于初代培养基（配方：MS+0.5 mg/L 6BA+30 g/L蔗糖+5.8 ~ 6.0 g/L琼脂）；
初代培养25～30 d，继代培养至增殖培养基（MS+0.6 mg/L 6BA+30 g/L蔗糖+5.8 ~ 6.0 g/L琼脂）中，继代培养15 ~ 20 d左右。
1.3 增殖培养基的筛选
探索杂种草莓三个株系的培养基中6BA的适宜浓度，进行分组实验。
1）配制培养基，培养基配方为：MS+5.8～6.0 g/L琼脂+30 g/L蔗糖+0.1 mg/L NAA +6BA，6BA设置4个浓度梯度，分别为0.6、0.8、1.0、1.2（mg∕L），对照组配方为：MS+30 g/L琼脂+5.8～6.0 g/L蔗糖；
3）观察各个浓度培养基内的杂种草莓的长势，统计同一时间内各个浓度培养基内的丛生芽数量，数量最多即为最佳的6BA浓度。
1.4 二倍体种间杂种的离体染色体加倍
1）将试管苗茎尖在无菌条件下转移至过滤灭菌的浓度分别为0、0.05 %、0.10 %、0.15 %、0.20 %的秋水仙素溶液中，茎尖浸泡时间分别为24 h、36 h、48 h、60 h；
2）实验处理共计有60个组合，每个组合处理48个茎尖，置于摇床上轻轻摇动，转速为120 r/min；
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摘 要1
引 言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料2
1.2 初代培养2
1.3 适合二倍体种间杂种的培养基2
1.4 二倍体种间杂种的离体加倍 3
1.5 诱导后的检测 4
2 结果与分析4
2.1 适宜草莓茎尖增殖的6BA浓度4
2.2 流式细胞仪检测种间杂种4
3 讨论8
3.1 秋水仙素诱导部位的选择 8
3.2 秋水仙素溶液的处理条件及特点8
3.3 四倍体诱导失败原因分析8
参考文献10
图 版11
致 谢13
秋水仙素诱导野生草莓杂交后代染色体加倍
引言
引言
从1937年Kreisler等人用秋水仙素处理曼陀罗获得多倍体开始，半个世纪以来，果树育种学家对多种果树进行了多倍体诱导的研究。到目前为止，已在梨、苹果、葡萄、草莓、柑橘、枣、猕猴桃、核桃等树种上成功诱导出多倍体植株[1]。多倍体植物由于染色体加倍，其外部形态特征和二倍体有明显的差别，主要表现在根、茎、叶的形态和大小上[2]。植物多倍化不仅使植株基因活性及酶的差异性增强，而且还增强了植株的生态适应性、对逆境的抗耐性以及降低了蒸腾作用，提高了光合效率等[3]。
草莓是蔷薇科草莓属（Fragaria）多年生草本植物。中国是世界上野生草莓资源最丰富的国家，长白山山脉、大兴安岭蕴藏着种类和数量极为丰富的野生草莓[4] *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
。野生草莓在提高栽培品种抗逆性、抗病性、芳香性、固形物含量等方面有较大潜力，因此国外很多学者进行了草莓种间杂交以获得新类型新品种[5,6]。但是，国内外有关草莓多倍体诱导的研究报道不多。Hull用秋水仙碱处理草莓杂种栽培品种Missionory Premier与智利草莓（F.chiloensis）杂交获得的杂种萌发种子得到16x加倍植株[7]，雷家军等用秋水仙碱处理草莓茎尖获得加倍植株[8]，但是以种子、茎尖为诱变材料，容易出现嵌合体。叶片离体再生的不定芽起源于单细胞[9]，在叶片离体再生过程中进行秋水仙碱处理，能够有效地获得同质突变体，这已在苹果[10]等植物上获得成功。我国研究人员大多用东北草莓(F. mandschurica)与凤梨草莓(Fragaria ananassa)或黄毛草莓（F.nilgerrensis）杂交，随后进行加倍处理[11]，本实验利用秋水仙素诱导绿色草莓(F.viridis)与东北草莓杂种染色体加倍尚属首次。
秋水仙素是微管特异性药物[12]，由于适宜浓度的秋水仙素，能破坏纺锤丝的形成，因此可使分生细胞复制的染色体在细胞分裂时不能分向两极，从而导致新生细胞的染色体加倍[7]。用秋水仙素诱导多倍体时，通常是用秋水仙素溶液浸泡或点滴处理分生组织，从而获得多倍体，所用浓度一般在0.01%0.4%[13]之间。离体组织细胞染色体加倍也以其容易控制实验条件和重复实验结果，提高工作效率，减少嵌合体等优势而逐渐受到重视。利用该法通过调整亲本的倍性，对克服远缘杂交的不孕性、远缘杂交的不实性、创造远缘杂交育种的中间亲本及培育作物新品种等方面具有积极的作用[14]。
染色体倍性鉴定方法最常用的是染色体数目鉴定法[15,16]。流式细胞仪(flow cytometer，FCM)也称倍性分析仪(ploidy analyzer)，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是比较先进的检测仪器。它可定量地测定某一细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同细胞的数量，近年来得到越来越广泛的应用。特别在植物育种方面，采用流式细胞仪可快速准确地鉴定各种植物的倍性，从而提高育种工作效率[17]。流式细胞仪鉴定植物倍性的原理为细胞DNA染色，每个细胞以均等时间依次通过测量区，经荧光染料染色的细胞受到激光照射后即发出荧光，由于DNA含量与荧光信号强度成正比关系，细胞发出的荧光信号强度可代表所测细胞核内的DNA含量，因而可用于植物倍性鉴定[18]。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料保存于大学牌楼草莓种质基地，是由绿色草莓为母本，东北草莓为父本杂交获得的杂种，共3个株系，统一编号为LsDb1101、LsDb1102、LsDb1103。
1.2 初代培养
剪取长约1.5～2.0 cm的田间匍匐茎茎尖为外植体，保湿带回实验室；
自来水流水冲洗4~6 h；
在超净工作台上依次用70 %乙醇消毒40 s、0.1 %升汞消毒8 min，无菌水冲洗4~ 5次，接种于初代培养基（配方：MS+0.5 mg/L 6BA+30 g/L蔗糖+5.8 ~ 6.0 g/L琼脂）；
初代培养25～30 d，继代培养至增殖培养基（MS+0.6 mg/L 6BA+30 g/L蔗糖+5.8 ~ 6.0 g/L琼脂）中，继代培养15 ~ 20 d左右。
1.3 增殖培养基的筛选
探索杂种草莓三个株系的培养基中6BA的适宜浓度，进行分组实验。
1）配制培养基，培养基配方为：MS+5.8～6.0 g/L琼脂+30 g/L蔗糖+0.1 mg/L NAA +6BA，6BA设置4个浓度梯度，分别为0.6、0.8、1.0、1.2（mg∕L），对照组配方为：MS+30 g/L琼脂+5.8～6.0 g/L蔗糖；
3）观察各个浓度培养基内的杂种草莓的长势，统计同一时间内各个浓度培养基内的丛生芽数量，数量最多即为最佳的6BA浓度。
1.4 二倍体种间杂种的离体染色体加倍
1）将试管苗茎尖在无菌条件下转移至过滤灭菌的浓度分别为0、0.05 %、0.10 %、0.15 %、0.20 %的秋水仙素溶液中，茎尖浸泡时间分别为24 h、36 h、48 h、60 h；
2）实验处理共计有60个组合，每个组合处理48个茎尖，置于摇床上轻轻摇动，转速为120 r/min；
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