外源一氧化氮缓解番茄低温胁迫的生理机制
3【目的】研究一氧化氮（nitric oxide, NO）作为植物生长和发育的调节分子，对低温胁迫下的番茄的保护作用。【方法】在温度为4℃的环境胁迫下，研究了0.05mmol/L至0.4mmol/L外源NO供体硝普钠（SNP）处理对两个不同品种番茄苗期的叶片保护酶活性及氧化损伤的影响。【结果】外源NO对番茄低温胁迫具有缓解作用，两个品种都以0.1mmol/L的SNP效果最好，均能提高低温下番茄叶片保护酶（如SOD、POD、CAT、APX）的活性和脯氨酸的含量，减少丙二醛（MDA）、可溶性蛋白含量和O2-的产生速率。【结论】外源NO对番茄低温胁迫的缓解作用具有剂量效应，0.05mmol/L的SNP能提高番茄的抗寒力，以0.1mmol/L的SNP效果最好。
目录
引言
引言
番茄是一种喜温蔬菜，对温度反应敏感，在番茄早春育苗、定植期间的低温往往造成其生长发育受阻，严重影响成株期的生长发育，早期产量和果实的商品性，低温已成为番茄生产上丰产与稳产的阻碍因子[1]。一氧化氮（nitric oxide,NO）是植物生长和发育的调节分子，能够对生物和非生物的逆境作出反应，是一种重要的生物活性分子，它对植物的种子萌发、生长发育、气孔运动、呼吸作用以及抗逆反应等生理过程均起重要的调节作用[2]。近年来，NO在植物抗逆性上的应用越来越受重视。已有大量的实验证明NO参与了植物生长发育的各个方面以及植物的抗逆反应。因此，探究NO与番茄低温胁迫缓解的关系具有重要意义。【国内外研究现状】NO对植物体具有保护和毒害两种效应，一方面，低浓度NO可作为抗氧化剂对O2等活性氧分子（ROS）具有清除作用，而且能够诱导抗氧化酶基因的表达，从而具有保护作用；另一方面，高浓度NO与O2相互作用生成大量的过氧亚硝酸阴离子（OONO），后者经质子化后形成具有强氧化性的过氧亚硝酸（HOONO），破坏生物大分子的结构与功能，具有生物毒性。Leshem等[3]最早发现NO对豌豆的生长和发育具有调控作用，Mata等[4]发现NO能够通过诱导小麦气孔关闭来提高其抗旱性；Uchida等[5]报道了NO对盐胁迫下水稻叶片的氧化损伤具有保护作用；张艳艳等[6]报道了NO能够缓解盐胁迫对玉米生长的抑制作用；阮海华等[7]发现NO对盐胁迫下小麦叶片的氧化损伤具有保护作用。吴雪霞 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
、朱月林等[8]研究了NO对NaCl胁迫下番茄幼苗生理影响。【本研究创新点】目前对NO的研究多集中在对盐胁迫和干旱胁迫的作用上，对低温胁迫的涉及较少。【拟解决的关键问题】本研究以番茄为材料，研究外施不同浓度 NO对低温胁迫下番茄幼苗生长、叶片保护酶活性和氧化损伤的影响，探讨NO缓解番茄低温胁迫的生理生化机理，为改善番茄低温胁迫提供理论依据，解决农业生产上番茄幼苗受到低温胁迫的问题。
1.材料与方法
1.1、材料
供试番茄品种为不耐低温品种LA27069（编号为192）和耐低温品种LA1777（编号为178）。
1.2、研究方法
1.2.1、材料培育：试验在大学生科楼温室进行。2013年3月上旬进行催芽，播种于穴盘中，出苗后定植于直径10cm，高10cm的塑料营养钵中，蛭石、珍珠岩、泥炭土做基质。每天浇适量水，真叶展开后，每2天浇1/2浓度日本园式营养液一次，每株50ml，长到3叶一心时，移栽到营养钵中，每株浇营养液80ml。
1.2.2、试验处理：5月上旬，待两个品种植株长到56叶一心时，放于光照培养箱中预培养两天后进行处理试验设6个处理：S0，对照（常温18℃）；S1，低温4℃；S2，低温4℃ + 0.05 mmol/L SNP（硝普钠，NO 供体）；S3，低温4℃ + 0.1 mmol/L SNP；S4，低温4℃ + 0.2 mmol/L SNP；S5，低温4℃ + 0.4 mmol/L SNP。每处理60 钵，3 次重复。培养四天后，取六个处理（S0~S5）叶片，每组三个重复，进行各项指标测定。
1.2.3、测定项目及方法：称取各处理组番茄叶片0.2g，三份重复，放入装有液氮的研钵中研磨，加入1.6ml的PBS缓冲液，转入5ml的离心管，12000离心速率下离心15分钟，离心所得的酶液置于冰箱中保存，用于测定番茄的酶活性。
超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定参照陈贻竹[9]的方法，依据超氧物歧化酶抑制氮蓝（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小；
POD酶测定用愈创木酚法[9]测定，即利用过氧化氢酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物的原理，因为醌类化合物会进一步缩合产生颜色较深的化合物，测定反应液的吸光值即可求酶活性大小；
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定按照Nakano和Asada的方法[10]；过氧化氢酶（CAT）活性的测定方法采用Cakmak等[11]的方法；
丙二醛（MDA）含量的测定采取硫代巴比妥酸法[12]，MDA与TBA生成有色物在530nm处有最大吸收，而其他的醛（烷醇、烯醇等）与TBA生成的有色物的最大吸收在450nm处，在两个波长处测定有色物的吸光度值，以此来衡量氧化程度，以μmol/g FW表示MDA含量；
O2产生速率的测定参照王爱国等的方法[13]，O2与羟胺发生反应产生NO2，NO2在对氨基苯磺酸和α—萘胺作用下，生成粉红色的偶氮染料，该染料在530nm处有最大光吸收，根据OD530可计算出样品中的O2含量；
脯氨酸含量的测定采用磺基水杨酸法[14]，在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的有色产物，该产物在?520nm?有一最大吸收峰，其色度与含量正相关，可用分光光度法测定；可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝染色法，考马斯亮蓝G250(Coomassie brilliant blue G250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm在一定蛋白质浓度范围内（11000μg），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可测得可溶性蛋白含量；
叶绿素含量采用95%乙醇法[15]测定，根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。取番茄叶片0.1g，三份重复，剪碎分别放入对应编号的试管中，加入10ml 95%乙醇，置于暗室黑暗处理24h后，测定叶绿素含量。
1.3、统计分析：
数据分析利用SPSS软件，作图用Microsoft Excel。
2.结果与分析
2.1、外源NO对低温胁迫下番茄苗期叶片叶绿素含量的影响
如表1.所示，各数据显示为样本叶绿素含量，通过SPSS分析可得出以下结论：与常温处理相比，4℃处理显著降低了不耐低温品种192和耐低温品种178的叶绿素a和叶绿素b的含量（除品种178的叶绿素b含量）。与4℃单独处理相比，4℃结合硝普钠处理可显著提高两品种的叶绿素含量，且大部分处理的叶绿素含量高于常温处理4℃单独处理（S1）的，随着SNP的浓度的增加，叶绿素含量均随之增加，在0.1mmol/L浓度的SNP处理组中，叶绿素含量最高，192品种在0.1mmol/LSNP的低温处理下叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b含量与4℃单独处理下含量比较分别增加了96.22%、34.6%、75.86%。178品种在S1处理下，叶绿素a与S0相比，含量下降，在S2、S3处理下，叶绿素含量明显上升，在0.1mmol/L SNP的低温处理下（S3）叶绿素含量最高，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b含量与4℃单独处理（S1）下含量比较分别增加了28.13%、23.66%、26.9%，但当SNP浓度超过0.1mmol/L时，两品种番茄叶片叶绿素含量均开始减少，表明高浓度SNP不能提高低温胁迫下番茄叶绿素的含量。
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引言
番茄是一种喜温蔬菜，对温度反应敏感，在番茄早春育苗、定植期间的低温往往造成其生长发育受阻，严重影响成株期的生长发育，早期产量和果实的商品性，低温已成为番茄生产上丰产与稳产的阻碍因子[1]。一氧化氮（nitric oxide,NO）是植物生长和发育的调节分子，能够对生物和非生物的逆境作出反应，是一种重要的生物活性分子，它对植物的种子萌发、生长发育、气孔运动、呼吸作用以及抗逆反应等生理过程均起重要的调节作用[2]。近年来，NO在植物抗逆性上的应用越来越受重视。已有大量的实验证明NO参与了植物生长发育的各个方面以及植物的抗逆反应。因此，探究NO与番茄低温胁迫缓解的关系具有重要意义。【国内外研究现状】NO对植物体具有保护和毒害两种效应，一方面，低浓度NO可作为抗氧化剂对O2等活性氧分子（ROS）具有清除作用，而且能够诱导抗氧化酶基因的表达，从而具有保护作用；另一方面，高浓度NO与O2相互作用生成大量的过氧亚硝酸阴离子（OONO），后者经质子化后形成具有强氧化性的过氧亚硝酸（HOONO），破坏生物大分子的结构与功能，具有生物毒性。Leshem等[3]最早发现NO对豌豆的生长和发育具有调控作用，Mata等[4]发现NO能够通过诱导小麦气孔关闭来提高其抗旱性；Uchida等[5]报道了NO对盐胁迫下水稻叶片的氧化损伤具有保护作用；张艳艳等[6]报道了NO能够缓解盐胁迫对玉米生长的抑制作用；阮海华等[7]发现NO对盐胁迫下小麦叶片的氧化损伤具有保护作用。吴雪霞 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
、朱月林等[8]研究了NO对NaCl胁迫下番茄幼苗生理影响。【本研究创新点】目前对NO的研究多集中在对盐胁迫和干旱胁迫的作用上，对低温胁迫的涉及较少。【拟解决的关键问题】本研究以番茄为材料，研究外施不同浓度 NO对低温胁迫下番茄幼苗生长、叶片保护酶活性和氧化损伤的影响，探讨NO缓解番茄低温胁迫的生理生化机理，为改善番茄低温胁迫提供理论依据，解决农业生产上番茄幼苗受到低温胁迫的问题。
1.材料与方法
1.1、材料
供试番茄品种为不耐低温品种LA27069（编号为192）和耐低温品种LA1777（编号为178）。
1.2、研究方法
1.2.1、材料培育：试验在大学生科楼温室进行。2013年3月上旬进行催芽，播种于穴盘中，出苗后定植于直径10cm，高10cm的塑料营养钵中，蛭石、珍珠岩、泥炭土做基质。每天浇适量水，真叶展开后，每2天浇1/2浓度日本园式营养液一次，每株50ml，长到3叶一心时，移栽到营养钵中，每株浇营养液80ml。
1.2.2、试验处理：5月上旬，待两个品种植株长到56叶一心时，放于光照培养箱中预培养两天后进行处理试验设6个处理：S0，对照（常温18℃）；S1，低温4℃；S2，低温4℃ + 0.05 mmol/L SNP（硝普钠，NO 供体）；S3，低温4℃ + 0.1 mmol/L SNP；S4，低温4℃ + 0.2 mmol/L SNP；S5，低温4℃ + 0.4 mmol/L SNP。每处理60 钵，3 次重复。培养四天后，取六个处理（S0~S5）叶片，每组三个重复，进行各项指标测定。
1.2.3、测定项目及方法：称取各处理组番茄叶片0.2g，三份重复，放入装有液氮的研钵中研磨，加入1.6ml的PBS缓冲液，转入5ml的离心管，12000离心速率下离心15分钟，离心所得的酶液置于冰箱中保存，用于测定番茄的酶活性。
超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定参照陈贻竹[9]的方法，依据超氧物歧化酶抑制氮蓝（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小；
POD酶测定用愈创木酚法[9]测定，即利用过氧化氢酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物的原理，因为醌类化合物会进一步缩合产生颜色较深的化合物，测定反应液的吸光值即可求酶活性大小；
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定按照Nakano和Asada的方法[10]；过氧化氢酶（CAT）活性的测定方法采用Cakmak等[11]的方法；
丙二醛（MDA）含量的测定采取硫代巴比妥酸法[12]，MDA与TBA生成有色物在530nm处有最大吸收，而其他的醛（烷醇、烯醇等）与TBA生成的有色物的最大吸收在450nm处，在两个波长处测定有色物的吸光度值，以此来衡量氧化程度，以μmol/g FW表示MDA含量；
O2产生速率的测定参照王爱国等的方法[13]，O2与羟胺发生反应产生NO2，NO2在对氨基苯磺酸和α—萘胺作用下，生成粉红色的偶氮染料，该染料在530nm处有最大光吸收，根据OD530可计算出样品中的O2含量；
脯氨酸含量的测定采用磺基水杨酸法[14]，在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的有色产物，该产物在?520nm?有一最大吸收峰，其色度与含量正相关，可用分光光度法测定；可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝染色法，考马斯亮蓝G250(Coomassie brilliant blue G250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm在一定蛋白质浓度范围内（11000μg），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可测得可溶性蛋白含量；
叶绿素含量采用95%乙醇法[15]测定，根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。取番茄叶片0.1g，三份重复，剪碎分别放入对应编号的试管中，加入10ml 95%乙醇，置于暗室黑暗处理24h后，测定叶绿素含量。
1.3、统计分析：
数据分析利用SPSS软件，作图用Microsoft Excel。
2.结果与分析
2.1、外源NO对低温胁迫下番茄苗期叶片叶绿素含量的影响
如表1.所示，各数据显示为样本叶绿素含量，通过SPSS分析可得出以下结论：与常温处理相比，4℃处理显著降低了不耐低温品种192和耐低温品种178的叶绿素a和叶绿素b的含量（除品种178的叶绿素b含量）。与4℃单独处理相比，4℃结合硝普钠处理可显著提高两品种的叶绿素含量，且大部分处理的叶绿素含量高于常温处理4℃单独处理（S1）的，随着SNP的浓度的增加，叶绿素含量均随之增加，在0.1mmol/L浓度的SNP处理组中，叶绿素含量最高，192品种在0.1mmol/LSNP的低温处理下叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b含量与4℃单独处理下含量比较分别增加了96.22%、34.6%、75.86%。178品种在S1处理下，叶绿素a与S0相比，含量下降，在S2、S3处理下，叶绿素含量明显上升，在0.1mmol/L SNP的低温处理下（S3）叶绿素含量最高，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b含量与4℃单独处理（S1）下含量比较分别增加了28.13%、23.66%、26.9%，但当SNP浓度超过0.1mmol/L时，两品种番茄叶片叶绿素含量均开始减少，表明高浓度SNP不能提高低温胁迫下番茄叶绿素的含量。
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