转cmpldα基因菊花耐旱性鉴定及耐旱机理研究
摘要：菊花(Chrysanthemum morifolium)为菊科菊属多年生草本植物，但抗逆性较差，易受非生物胁迫的影响。磷脂酶 D（PLD），能催化磷酸二酯键水解及碱基交换反应，植物逆境胁迫与PLD表达量有关。本研究对菊花磷脂酶D编码基因CmPLDα的超表达（Z1,Z2）及反义转基因株系（F1,F2）进行20% PEG6000模拟干旱以鉴定其抗旱性。结果表明，正义株系轻度萎蔫，存活率和含水量高于野生型，电导率及MDA含量则低于野生型；反义株系重度萎蔫，存活率和含水量低于野生型，而电导率及MDA含量高于野生型，说明正义株系膜完整度及稳定性高于野生型及反义株系。ABA含量：正义株系高于野生型，反义株系低于野生型，推测水分胁迫下ABA参与诱导气孔关闭来减少水分丧失。即CmPLDα基因可以维持膜的稳定性及通过ABA介导菊花抗旱性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 植物材料2
1.1.2 试剂与仪器2
1.2 方法 2
1.2.1 干旱胁迫模拟设计2
1.2.2 干旱处理后形态测定2
1.2.3 干旱处理后生理指标测定2
1.2.3.1叶片相对含水量的测定2
1.2.3.2 叶片相对电导率的测定2
1.2.3.3 丙二醛含量的测定2
1.2.3.4 ABA的测定2
1.2.4 统计分析3
2 结果与分析3
2.1 形态指标分析3
2.2 生理指标分析 4
2.2.1 叶片相对含水量 4
2.2.2 叶片相对电导率和丙二醛（MDA）的含量 5
2.2.3 ABA的含量 6
3 讨论 7
致谢7
参考文献7
图1 PEG模拟干旱胁迫24h后未转基因和转基因植株形态及萎蔫指数的变化情况3
图2 PEG模拟干旱胁迫处理（A）及恢复生长存活率（B）4
图3 干旱胁迫对未
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
转基因和转基因植株叶片相对含水量的影响5
图4 干旱胁迫对未转基因和转基因植株叶片电导率含量的影响5
图5 干旱胁迫对未转基因和转基因植株丙二醛含量的影响6
图6 干旱胁迫对未转基因和转基因植株ABA含量的影响 6
转CmPLDα基因菊花耐旱性鉴定及耐旱机理研究
引言
引言
菊花是十大传统名花之一，被广泛应用于城市绿化。其中，切花菊约占世界切花总量的30%，在花卉产业中占据十分重要的地位。缺水是农业及园艺生产所共同面临的主要问题之一，干旱常导致植物生长不良，严重时甚至危及植物的存活。因此，提高植物在不良环境条件下的抗逆能力，并采取相应措施减少逆境对植物的损害，对于提高菊花的产量和质量具有重要的意义。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 植物材料
切花菊‘神马’的野生型（SM）、正义株系（Z1、Z2）与反义株系（F1、F2）植株，培养于大学花卉遗传育种与分子生物学实验室的温室。
1．1．2 试剂与仪器
PEG6000、5%三氯乙酸（TCA）、0.67%硫代巴比妥酸（TBA）、80%色谱甲醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、乙酸。
4℃/20℃冰箱（Haier）、80℃超低温冰箱（Thermo）、气浴恒温震荡箱（Hz921K，华利达）、制冰机（SANYO）、烘箱、电子天平、数码相机、电导仪、水浴锅（DK8D 数显恒温水浴锅）、研钵、冷冻离心机、分光光度计、C18 SPE固相萃取柱、冷冻干燥机、高效液相色谱仪。
1．2 方法
1．2．1 干旱胁迫模拟设计
将生长一致健壮的转基因植株及野生型植株种植于塑料杯中，栽培基质为珍珠岩：蛭石：营养土（1:1:1，v/v/v）的基质，种植于温室中（23土2℃，12h/12h光周期)，将810叶龄的正义转基因Z1、Z2和反义转基因F1、F2植株及野生型植株SM根部清洗干净，浸泡在20% PEG6000溶液中，模拟干旱胁迫24h。
1．2．2 干旱处理后形态测定
取出各处理植株，用去离子水冲洗植株3遍，放入水中恢复生长一周后拍照记录植株的形态变化及萎蔫指数，恢复生长后统计植株存活率，实验重复3次。
1．2．3 干旱处理后生理指标测定
于干旱胁迫的0、1、4、8、12、24h后进行取样
1.2.3.1 叶片相对含水量的测定
叶片相对含水量（RWC）= (鲜重干重)/鲜重×100%
1.2.3.2 叶片相对电导率的测定
取大小相当的植物叶片(尽量保证叶片的完整性)，用自来水洗净后再用蒸馏水冲洗3次，用滤纸吸干表面水分，将叶片剪成适宜长度的长条(避开主脉)，快速称取鲜样3份，每份0.1g，分别置于10ml去离子水的刻度试管中，盖上玻璃塞置于室温下浸泡处理12h。用电导仪测定浸提液电导(R1)，然后沸水浴加热30min，冷却至室温后摇匀,再次测定浸提液电导(R2)，按照公式：相对电导率REL =（初始电导率R1/加热冷却后电导率R2）×100% 计算，每个处理进行3次重复。
1.2.3.3 丙二醛（MDA）含量的测定
采用硫代巴比妥酸比色法进行测定：取0.5g植物叶片，加5%的TCA 5ml，研磨后所得匀浆在3000r/min下离心10min。取上清液2ml，加入0.67%TBA 2ml，混合后在100℃水浴上煮沸30min，冷却后再离心一次。分别测定上清液在450nm、532nm和600nm处的吸光度值，并按照公式：C/μmol/l = 6.45(A532A600)0.56A450，算出丙二醛的浓度，再计算单位鲜量组织中丙二醛的含量，每个处理重复3次。
1.2.3.4 ABA含量测定
称取1.0 g叶片放入预冷研钵中，液氮充分研磨，加入10 ml预冷的80%色谱甲醇，4℃避光浸提12 h以上，将上清转入另一干净的50 ml离心管。残渣用预冷的80%色谱甲醇再次浸提，将两次上清液合并，加入0.2 g PVP充分混合，4℃避光震荡1 h后取上清液，过C18 SPE固相萃取小柱后用冻干机将其冷冻干燥。高效液相色谱进行测定，流动相为甲醇和含1.0%乙酸超纯水，流速为0.9 mlmin1，柱温为35 ℃，检测紫外波长为254 nm，进样量为20 μl，手动进样。配制浓度梯度标准溶液，制作标准曲线，每个处理进行3次重复。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 植物材料2
1.1.2 试剂与仪器2
1.2 方法 2
1.2.1 干旱胁迫模拟设计2
1.2.2 干旱处理后形态测定2
1.2.3 干旱处理后生理指标测定2
1.2.3.1叶片相对含水量的测定2
1.2.3.2 叶片相对电导率的测定2
1.2.3.3 丙二醛含量的测定2
1.2.3.4 ABA的测定2
1.2.4 统计分析3
2 结果与分析3
2.1 形态指标分析3
2.2 生理指标分析 4
2.2.1 叶片相对含水量 4
2.2.2 叶片相对电导率和丙二醛（MDA）的含量 5
2.2.3 ABA的含量 6
3 讨论 7
致谢7
参考文献7
图1 PEG模拟干旱胁迫24h后未转基因和转基因植株形态及萎蔫指数的变化情况3
图2 PEG模拟干旱胁迫处理（A）及恢复生长存活率（B）4
图3 干旱胁迫对未
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
转基因和转基因植株叶片相对含水量的影响5
图4 干旱胁迫对未转基因和转基因植株叶片电导率含量的影响5
图5 干旱胁迫对未转基因和转基因植株丙二醛含量的影响6
图6 干旱胁迫对未转基因和转基因植株ABA含量的影响 6
转CmPLDα基因菊花耐旱性鉴定及耐旱机理研究
引言
引言
菊花是十大传统名花之一，被广泛应用于城市绿化。其中，切花菊约占世界切花总量的30%，在花卉产业中占据十分重要的地位。缺水是农业及园艺生产所共同面临的主要问题之一，干旱常导致植物生长不良，严重时甚至危及植物的存活。因此，提高植物在不良环境条件下的抗逆能力，并采取相应措施减少逆境对植物的损害，对于提高菊花的产量和质量具有重要的意义。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 植物材料
切花菊‘神马’的野生型（SM）、正义株系（Z1、Z2）与反义株系（F1、F2）植株，培养于大学花卉遗传育种与分子生物学实验室的温室。
1．1．2 试剂与仪器
PEG6000、5%三氯乙酸（TCA）、0.67%硫代巴比妥酸（TBA）、80%色谱甲醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、乙酸。
4℃/20℃冰箱（Haier）、80℃超低温冰箱（Thermo）、气浴恒温震荡箱（Hz921K，华利达）、制冰机（SANYO）、烘箱、电子天平、数码相机、电导仪、水浴锅（DK8D 数显恒温水浴锅）、研钵、冷冻离心机、分光光度计、C18 SPE固相萃取柱、冷冻干燥机、高效液相色谱仪。
1．2 方法
1．2．1 干旱胁迫模拟设计
将生长一致健壮的转基因植株及野生型植株种植于塑料杯中，栽培基质为珍珠岩：蛭石：营养土（1:1:1，v/v/v）的基质，种植于温室中（23土2℃，12h/12h光周期)，将810叶龄的正义转基因Z1、Z2和反义转基因F1、F2植株及野生型植株SM根部清洗干净，浸泡在20% PEG6000溶液中，模拟干旱胁迫24h。
1．2．2 干旱处理后形态测定
取出各处理植株，用去离子水冲洗植株3遍，放入水中恢复生长一周后拍照记录植株的形态变化及萎蔫指数，恢复生长后统计植株存活率，实验重复3次。
1．2．3 干旱处理后生理指标测定
于干旱胁迫的0、1、4、8、12、24h后进行取样
1.2.3.1 叶片相对含水量的测定
叶片相对含水量（RWC）= (鲜重干重)/鲜重×100%
1.2.3.2 叶片相对电导率的测定
取大小相当的植物叶片(尽量保证叶片的完整性)，用自来水洗净后再用蒸馏水冲洗3次，用滤纸吸干表面水分，将叶片剪成适宜长度的长条(避开主脉)，快速称取鲜样3份，每份0.1g，分别置于10ml去离子水的刻度试管中，盖上玻璃塞置于室温下浸泡处理12h。用电导仪测定浸提液电导(R1)，然后沸水浴加热30min，冷却至室温后摇匀,再次测定浸提液电导(R2)，按照公式：相对电导率REL =（初始电导率R1/加热冷却后电导率R2）×100% 计算，每个处理进行3次重复。
1.2.3.3 丙二醛（MDA）含量的测定
采用硫代巴比妥酸比色法进行测定：取0.5g植物叶片，加5%的TCA 5ml，研磨后所得匀浆在3000r/min下离心10min。取上清液2ml，加入0.67%TBA 2ml，混合后在100℃水浴上煮沸30min，冷却后再离心一次。分别测定上清液在450nm、532nm和600nm处的吸光度值，并按照公式：C/μmol/l = 6.45(A532A600)0.56A450，算出丙二醛的浓度，再计算单位鲜量组织中丙二醛的含量，每个处理重复3次。
1.2.3.4 ABA含量测定
称取1.0 g叶片放入预冷研钵中，液氮充分研磨，加入10 ml预冷的80%色谱甲醇，4℃避光浸提12 h以上，将上清转入另一干净的50 ml离心管。残渣用预冷的80%色谱甲醇再次浸提，将两次上清液合并，加入0.2 g PVP充分混合，4℃避光震荡1 h后取上清液，过C18 SPE固相萃取小柱后用冻干机将其冷冻干燥。高效液相色谱进行测定，流动相为甲醇和含1.0%乙酸超纯水，流速为0.9 mlmin1，柱温为35 ℃，检测紫外波长为254 nm，进样量为20 μl，手动进样。配制浓度梯度标准溶液，制作标准曲线，每个处理进行3次重复。
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