大蒜呼吸爆发氧化酶基因asrboh的克隆及其特征分析
摘要：以大蒜品种‘二水早’为试材，应用同源克隆和RACE技术克隆到大蒜呼吸爆发氧化酶（respiratory burst oxidase homologue, Rboh）基因cDNA全长序列，命名为AsRBOH，其长度为2915bp，开放阅读框（ORF）为2766bp，编码922个氨基酸，氨基酸的相对分子量为103.87 kD，等电点（PI）为9.82431030273438。氨基酸同源性分析发现，AsRBOH与其他物种的RBOH基因高度同源，进化分析发现，与玉米的Rboh氨基酸序列同源性最高，达93%；对该基因的亚细胞定位进行预测，结果发现其在细胞质膜上的可能性最大。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key word 1
引言： 1
1 材料与方法 2
1.1 实验材料 2
1.1.1 植物材料 2
1.1.2 菌株、质粒及试剂 2
1.1.3 常用储液 2
1.2 实验方法 2
1.2.2 引物的设计 3
1.2.3 大蒜Rboh的扩增 3
1.2.4 3’RACE 4
1.2.5 5＇RACE 5
1.2.6 目的片段的回收 7
1.2.7 序列测定及分析 7
1.2.8 qRTPCR 7
2 结果与分析 7
2.1 Rboh全长cDNA序列的获得 7
2.2 Rboh 推导的氨基酸序列同源性及进化树分析 9
2.3 Rboh的生物信息学分析 11
3 讨论 12
致谢 13
参考文献： 13
大蒜呼吸爆发氧化酶基因AsRBOH的克隆及其特征分析
引言
大蒜（Allium sativum L.）又名蒜，葫蒜，是百合科葱属二年生草本植物，有植物黄金之称，为世界范围广泛栽培和食用的药食兼用蔬菜[1]，也是我国在国际市场上有较强竞争力的重要出口蔬菜，其精深加工产品走俏欧洲、美国，越来越多的研究表明大蒜及其组分对癌症有化
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学预防作用[2]。此外，大蒜种植时间较长，约为200~250d，常年的无性繁殖常常会遇到各种逆境胁迫[34]。有研究发现，植物在各种生物胁迫下，都会产生ROS的“氧化爆发”。近年来，利用突变体从基因水平证明，植物“氧化爆发”与植物逆境胁迫响应有着密切的关系[5]。许树成[6]等在玉米叶片中克隆了NADPH氧化酶Zmrboh的3个基因，并发现其表达均可因ABA和水分胁迫而增强。NADPH氧化酶与Cu, Fe, Zn, Cd及Cr等重金属胁迫关系密切。Cu缺乏或过量能导致NADPH氧化酶依赖的ROS升高[7]。
植物呼吸爆发氧化酶（respiratory burst oxidase homologue, Robh），又称NADPH氧化酶，是一类在大部分真核生物中普遍存在的氧化酶，位于质膜（plasma membrane）或吞噬小体膜（phagosome membrane）上，是膜氧化还原系统的重要组成部分[8]，它能以胞质中的NADPH为直接电子供体，将氧催化生成O2，后者随即发生歧化反应生成H2O2以及其它的ROS分子[9]。许多证据显示，不同逆境因素在作用于植物细胞时都具有一个共同的和主要的特征，即产生一类化学性质活泼、氧化能力极强的含氧物质活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）[1014]。NADPH氧化酶可引起ROS的产生[1516]，有研究发现，大蒜试管苗玻璃化过程中质外体的氧化爆发是试管苗爆发的关键因素（Tian et al., 2014）。研究表明，质膜NADPH氧化酶通过催化产生ROS，在抵御病原物、应答非生物胁迫反应以及调节植物的生长发育中起非常重要的作用。
植物Rboh 基因主要在植物生长发育及胁迫反应中起作用，其活性主要受Ca2+、蛋白磷酸化、Rac 蛋白及 ABA 所调控[17]。当植物受到生物或非生物胁迫时， 该酶通过短时间内大量产生信号分子活性氧调节基因表达和细胞代谢，使植物及时对逆境胁迫作出反应，以适应环境的变化[18]。
巨噬细胞NADPH氧化酶主要的功能亚基gp91 PHOX，虽然也还没有同源植物蛋白被纯化的报道，但编码gp91PHOX同源蛋白的植物基因从1990年代后期开始陆续被发现，命名为rboh基因(respiratory burst oxidase homologues gene)。首先克隆成功是在水稻根部和幼苗转录的OsrbohA基因。此后又有多种植物rboh基因被克隆，如马铃薯、拟南芥、烟草和番茄等。
虽然Rboh已有较多研究，但有关大蒜Rboh还少有报道。为此，本研究以大蒜为材料，克隆到大蒜中的呼吸爆发氧化酶基因AsRBOH，通过生物信息学分析该基金基本特征，为进一步研究RBOH的功能和表达特征奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 植物材料
研究用大蒜品种为‘二水早’，保存于大学园艺学院。在蒜薹的花茎发育相对高度（花茎高度/假茎高度）为1，花序轴上表面直径为0.5cm时，将总苞带2cm薹段剪下进行处理。将剪下的蒜薹总苞置于饱和洗衣粉溶液中浸泡20min，然后再用自来水冲洗30min。将充分冲洗的蒜薹总苞置于超净工作台上，以70%酒精进行表面消毒30s，2%次氯酸钠溶液浸泡消毒12min后，再用无菌水冲洗5次。剥去外层苞叶，去除花茎部分及花序轴表面的花原基残留物和膜质苞片。将花序轴纵切为4块，接种于初代培养基（B5+6BA 1.0mg/L +0.65%琼脂+3%蔗糖）上，置于温度25℃、光照时间12 h/d，光照强度约为90μmolm2s1的条件下培养。以诱导形成的生长一致的丛生芽为材料。
1.1.2 菌株、质粒及试剂
大肠杆菌菌株DH5а、农杆菌菌株EHA105由本实验室保存，Tap DNA聚合酶，RNA酶抑制剂、各种限制性内切酶、T4连接酶、SYBRpremix EXTagTM reagent试剂盒、质粒载体pMDT19simple等均购自Takara公司。DNA回收试剂盒购于天根公司。潮霉素(hygromycin)购自Roche公司。
1.1.3 常用储液
Xgal（20mg/ml）储液的配制：0.2g Xgal溶于10ml的二甲基甲酰胺，分装于1.5ml的离心管中，避光存储于20℃。
ITPG储液（24mg/ml）的配制：240mg ITPG溶于10ml蒸馏水中，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于1.5ml的离心管中，存储于20℃。
LB培养基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，pH7.0（固体培养基另加1.5%的琼脂粉）。
YEB培养基：0.5%牛肉膏，0.1%J酵母提取物，0.5%蛋白胨，0.5%葡萄糖，0.05% MgSO4*7H2O（固体培养基另加1.5%的琼脂粉）。
DNA提取缓冲液：83.5mM TrisHCl（pH 8.0），1.17g NaCl，16.7mM EDTA（pH
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key word 1
引言： 1
1 材料与方法 2
1.1 实验材料 2
1.1.1 植物材料 2
1.1.2 菌株、质粒及试剂 2
1.1.3 常用储液 2
1.2 实验方法 2
1.2.2 引物的设计 3
1.2.3 大蒜Rboh的扩增 3
1.2.4 3’RACE 4
1.2.5 5＇RACE 5
1.2.6 目的片段的回收 7
1.2.7 序列测定及分析 7
1.2.8 qRTPCR 7
2 结果与分析 7
2.1 Rboh全长cDNA序列的获得 7
2.2 Rboh 推导的氨基酸序列同源性及进化树分析 9
2.3 Rboh的生物信息学分析 11
3 讨论 12
致谢 13
参考文献： 13
大蒜呼吸爆发氧化酶基因AsRBOH的克隆及其特征分析
引言
大蒜（Allium sativum L.）又名蒜，葫蒜，是百合科葱属二年生草本植物，有植物黄金之称，为世界范围广泛栽培和食用的药食兼用蔬菜[1]，也是我国在国际市场上有较强竞争力的重要出口蔬菜，其精深加工产品走俏欧洲、美国，越来越多的研究表明大蒜及其组分对癌症有化
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
学预防作用[2]。此外，大蒜种植时间较长，约为200~250d，常年的无性繁殖常常会遇到各种逆境胁迫[34]。有研究发现，植物在各种生物胁迫下，都会产生ROS的“氧化爆发”。近年来，利用突变体从基因水平证明，植物“氧化爆发”与植物逆境胁迫响应有着密切的关系[5]。许树成[6]等在玉米叶片中克隆了NADPH氧化酶Zmrboh的3个基因，并发现其表达均可因ABA和水分胁迫而增强。NADPH氧化酶与Cu, Fe, Zn, Cd及Cr等重金属胁迫关系密切。Cu缺乏或过量能导致NADPH氧化酶依赖的ROS升高[7]。
植物呼吸爆发氧化酶（respiratory burst oxidase homologue, Robh），又称NADPH氧化酶，是一类在大部分真核生物中普遍存在的氧化酶，位于质膜（plasma membrane）或吞噬小体膜（phagosome membrane）上，是膜氧化还原系统的重要组成部分[8]，它能以胞质中的NADPH为直接电子供体，将氧催化生成O2，后者随即发生歧化反应生成H2O2以及其它的ROS分子[9]。许多证据显示，不同逆境因素在作用于植物细胞时都具有一个共同的和主要的特征，即产生一类化学性质活泼、氧化能力极强的含氧物质活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）[1014]。NADPH氧化酶可引起ROS的产生[1516]，有研究发现，大蒜试管苗玻璃化过程中质外体的氧化爆发是试管苗爆发的关键因素（Tian et al., 2014）。研究表明，质膜NADPH氧化酶通过催化产生ROS，在抵御病原物、应答非生物胁迫反应以及调节植物的生长发育中起非常重要的作用。
植物Rboh 基因主要在植物生长发育及胁迫反应中起作用，其活性主要受Ca2+、蛋白磷酸化、Rac 蛋白及 ABA 所调控[17]。当植物受到生物或非生物胁迫时， 该酶通过短时间内大量产生信号分子活性氧调节基因表达和细胞代谢，使植物及时对逆境胁迫作出反应，以适应环境的变化[18]。
巨噬细胞NADPH氧化酶主要的功能亚基gp91 PHOX，虽然也还没有同源植物蛋白被纯化的报道，但编码gp91PHOX同源蛋白的植物基因从1990年代后期开始陆续被发现，命名为rboh基因(respiratory burst oxidase homologues gene)。首先克隆成功是在水稻根部和幼苗转录的OsrbohA基因。此后又有多种植物rboh基因被克隆，如马铃薯、拟南芥、烟草和番茄等。
虽然Rboh已有较多研究，但有关大蒜Rboh还少有报道。为此，本研究以大蒜为材料，克隆到大蒜中的呼吸爆发氧化酶基因AsRBOH，通过生物信息学分析该基金基本特征，为进一步研究RBOH的功能和表达特征奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 植物材料
研究用大蒜品种为‘二水早’，保存于大学园艺学院。在蒜薹的花茎发育相对高度（花茎高度/假茎高度）为1，花序轴上表面直径为0.5cm时，将总苞带2cm薹段剪下进行处理。将剪下的蒜薹总苞置于饱和洗衣粉溶液中浸泡20min，然后再用自来水冲洗30min。将充分冲洗的蒜薹总苞置于超净工作台上，以70%酒精进行表面消毒30s，2%次氯酸钠溶液浸泡消毒12min后，再用无菌水冲洗5次。剥去外层苞叶，去除花茎部分及花序轴表面的花原基残留物和膜质苞片。将花序轴纵切为4块，接种于初代培养基（B5+6BA 1.0mg/L +0.65%琼脂+3%蔗糖）上，置于温度25℃、光照时间12 h/d，光照强度约为90μmolm2s1的条件下培养。以诱导形成的生长一致的丛生芽为材料。
1.1.2 菌株、质粒及试剂
大肠杆菌菌株DH5а、农杆菌菌株EHA105由本实验室保存，Tap DNA聚合酶，RNA酶抑制剂、各种限制性内切酶、T4连接酶、SYBRpremix EXTagTM reagent试剂盒、质粒载体pMDT19simple等均购自Takara公司。DNA回收试剂盒购于天根公司。潮霉素(hygromycin)购自Roche公司。
1.1.3 常用储液
Xgal（20mg/ml）储液的配制：0.2g Xgal溶于10ml的二甲基甲酰胺，分装于1.5ml的离心管中，避光存储于20℃。
ITPG储液（24mg/ml）的配制：240mg ITPG溶于10ml蒸馏水中，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于1.5ml的离心管中，存储于20℃。
LB培养基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，pH7.0（固体培养基另加1.5%的琼脂粉）。
YEB培养基：0.5%牛肉膏，0.1%J酵母提取物，0.5%蛋白胨，0.5%葡萄糖，0.05% MgSO4*7H2O（固体培养基另加1.5%的琼脂粉）。
DNA提取缓冲液：83.5mM TrisHCl（pH 8.0），1.17g NaCl，16.7mM EDTA（pH
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