北沙参愈伤组织诱导条件优化
[目的]优化北沙参愈伤组织诱导条件。比较不同激素及外植体对北沙参愈伤组织诱导的影，筛选最优培养基配方对北沙参野生居群进行种质资源保存。解决北沙参植物组织培养中次生代谢物抑制细胞脱分化问题。[方法]外植体为叶片、叶柄、茎节和子房，MS为基本培养基，正交试验法设计6-BA、NAA和2,4-D不同水平处理组合。叶片愈伤组织继代培养中研究不同质量浓度活性炭对叶片愈伤组织生长影响及抗褐变效果。[结果]不同激素对北沙参愈伤组织诱导影响依次为6-BA＞2,4-D＞NAA。选择叶片、子房作为诱导愈伤组织最佳外植体。在培养基中添加1.5g/L活性炭可有效降低叶片愈伤组织褐变。[结论]确定叶片为北沙参愈伤组织诱导及品种保存最佳外植体，最佳培养条件为MS+1.0 mg/L6-BA+0.3 mg/2,4-D+0.2 mg/LNAA+1.5 g/L AC。
目录
摘要1
关键词1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1外植体 2
1.1.2 试剂 2
1.1.3 仪器及设备 2
1.2方法 2
1.2.1 外植体处理 2
1.2.2 愈伤组织诱导激素水平处理 3
1.2.3 叶片愈伤组织诱导过程中的抗褐变处理 3
1.2.4 数据处理 3
2 结果与分析 3
2.1不同激素处理对北沙参愈伤组织诱导的影响 3
2.2不同外植体对愈伤组织诱导的影响 4
2.3不同质量溶度活性炭对叶片愈伤组织生长及其抗褐变影响 5
3 讨论 6
致谢6
参考文献7
Abstract8
引言
北沙参愈伤组织诱导条件优化
北沙参为伞形科植物珊瑚菜（Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.）的干燥根茎，具有养阴清肺，益胃生津的功效。早在《神农本草经》中就被列为上品，药用历史悠久[]。如今，北沙参市场需求量不断增加，北沙参的引种区域随之扩大，栽培生产及采收加工技术日益混乱，栽培历史久远，种质资源退化现象严重，药 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
材质量受到严重影响[]。药材质量保证、产量成为药材市场销售的把关环节。调查表示，北沙参野外资源已濒临灭绝，分布零星[]。早在1999年野生北沙参就被列为国家Ⅱ级重点保护野生植物，而优势种选育有赖于野生植物的引种及驯化。
北沙参从种子萌发至开花结果需时两年，种子具种胚后熟的低温休眠特性，加之北沙参种子寿命短，隔年种子发芽率显著下降，3年后几乎丧失发芽能力。这不利于野生北沙参种质资源保存。植物组织培养作为品种保存的良好途径，根据植物离体组织的全能性即可培育出完整植株，建立无性系，为品种改良、选育等做实验基础。前人多以北沙参根茎为外植体，经过从生芽诱导分化途径直接获得无菌苗[][][]。这种方式不利于单株野生品种的保存，容易导致稀缺资源浪费。此外，国内外对北沙参化学成分、药理作用、本草考证、种质资源等各方面有悠久的研究历史[]，日本还对北沙参形态学、胚胎学方面进行了大量研究[][]，组织培养研究报道不多，处于研究初级阶段，研究内容主要集中在外植体选择、生长调节物质配比及培养基配方等，近年来逐渐走向分子学领域[]。
本实验拟设计通过组织培养的方式对其进行品种保存和评价。通过正交试验设计法配比不同的培养基配方，以解决其因次生代谢产物影响细胞脱分化能力而导致的组织培养技术不完全。
1 材料与方法
1.1 材料
图1：供实验用北沙参植株形态
1.1.2 试剂、仪器及设备 6苄氨基腺嘌呤（6Benzylaminopurine），简称6BA）、1萘乙酸（1Naphthaleneacetic acid，简称NAA）、2,4二氯苯氧乙酸（2,4dichlorophenoxyacetic acid，简称2,4D），MS培养基母液，琼脂，蔗糖，NaOH溶液，HCL溶液，PH试纸（5.5～9.0），0.1%升汞，活性炭，无水乙醇等。超净工作台，高压灭菌锅，电子天平，解剖镜，培养瓶，手术刀，镊子，大号培养皿，滤纸等。
1.2 方法
1.2.1 外植体处理 嫩叶、叶柄、茎节处理：将离体的外植体用流水冲洗干净后以洗衣粉浸泡30 min，洗净。在超净工作台上用无菌水冲洗2遍后75%酒精漂洗8s，无菌水冲洗4遍，0.1%升汞浸泡30 min后用无菌水冲洗6遍。在无菌滤纸上将无菌嫩叶切成0.5㎝×0.5㎝小块（叶柄、茎切段1.0㎝）备用。子房获取：将离体的北沙参花絮洗净消毒完全后，在解剖镜下用镊子和手术刀拨开小花被，剖取子房。
将准备好的外植体分别接种到培养基上。每个处理接种5瓶，每瓶接种8个外植体，每处理总数40个外植体。在温度（25±3）℃，光照12hd1，光照强度为1000～1500lx的培养室中培养。每2天进培养室观察材料生长情况，及时转接处理污染材料，以便数据统计。培养45天后统一计算出愈率。
1.2.2愈伤组织诱导激素水平处理 北沙参愈伤组织诱导实验采用L9（34）正交设计法[]，以6BA 、NAA、2,4D质量溶度为参考因素，每种激素设置3个水平，见表1所示。
表1 北沙参愈伤组织诱导的激素水平
Tab 1 the Level and Factor of Hormones for Inducing Callus of Glehnia Littoralis
水平
Level
因素
Factor
6BA/ mg/L
NAA/ mg/L
2,4D/ mg/L
1
1
0.1
0.1
2
1.5
0.2
0.2
3
2.0
0.3
0.3
根据L9（34）表设计9组不同处理的激素诱导体系，考察三种不同激素对北沙参愈伤组织诱导的影响[]。基本培养基为MS调PH5.8，琼脂为7 g/L。北沙参愈伤组织诱导培养基配比正交实验设计表见下表2所示：
表2 北沙参愈伤组织诱导3因素3水平正交实验设计
Tab2 Orthogonal Experimental Design for Callus Induction of Glehnia Littoralis
编号
No.
培养基配方／mg/L
Treatment / mg/L
6BA NAA 2，4D
B1
1.0 0.1 0.1
B2
1.0 0.2 0.2
B3
1.0 0.3 0.3
B4
1.5 0.2 0.3
目录
摘要1
关键词1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1外植体 2
1.1.2 试剂 2
1.1.3 仪器及设备 2
1.2方法 2
1.2.1 外植体处理 2
1.2.2 愈伤组织诱导激素水平处理 3
1.2.3 叶片愈伤组织诱导过程中的抗褐变处理 3
1.2.4 数据处理 3
2 结果与分析 3
2.1不同激素处理对北沙参愈伤组织诱导的影响 3
2.2不同外植体对愈伤组织诱导的影响 4
2.3不同质量溶度活性炭对叶片愈伤组织生长及其抗褐变影响 5
3 讨论 6
致谢6
参考文献7
Abstract8
引言
北沙参愈伤组织诱导条件优化
北沙参为伞形科植物珊瑚菜（Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.）的干燥根茎，具有养阴清肺，益胃生津的功效。早在《神农本草经》中就被列为上品，药用历史悠久[]。如今，北沙参市场需求量不断增加，北沙参的引种区域随之扩大，栽培生产及采收加工技术日益混乱，栽培历史久远，种质资源退化现象严重，药 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
材质量受到严重影响[]。药材质量保证、产量成为药材市场销售的把关环节。调查表示，北沙参野外资源已濒临灭绝，分布零星[]。早在1999年野生北沙参就被列为国家Ⅱ级重点保护野生植物，而优势种选育有赖于野生植物的引种及驯化。
北沙参从种子萌发至开花结果需时两年，种子具种胚后熟的低温休眠特性，加之北沙参种子寿命短，隔年种子发芽率显著下降，3年后几乎丧失发芽能力。这不利于野生北沙参种质资源保存。植物组织培养作为品种保存的良好途径，根据植物离体组织的全能性即可培育出完整植株，建立无性系，为品种改良、选育等做实验基础。前人多以北沙参根茎为外植体，经过从生芽诱导分化途径直接获得无菌苗[][][]。这种方式不利于单株野生品种的保存，容易导致稀缺资源浪费。此外，国内外对北沙参化学成分、药理作用、本草考证、种质资源等各方面有悠久的研究历史[]，日本还对北沙参形态学、胚胎学方面进行了大量研究[][]，组织培养研究报道不多，处于研究初级阶段，研究内容主要集中在外植体选择、生长调节物质配比及培养基配方等，近年来逐渐走向分子学领域[]。
本实验拟设计通过组织培养的方式对其进行品种保存和评价。通过正交试验设计法配比不同的培养基配方，以解决其因次生代谢产物影响细胞脱分化能力而导致的组织培养技术不完全。
1 材料与方法
1.1 材料
图1：供实验用北沙参植株形态
1.1.2 试剂、仪器及设备 6苄氨基腺嘌呤（6Benzylaminopurine），简称6BA）、1萘乙酸（1Naphthaleneacetic acid，简称NAA）、2,4二氯苯氧乙酸（2,4dichlorophenoxyacetic acid，简称2,4D），MS培养基母液，琼脂，蔗糖，NaOH溶液，HCL溶液，PH试纸（5.5～9.0），0.1%升汞，活性炭，无水乙醇等。超净工作台，高压灭菌锅，电子天平，解剖镜，培养瓶，手术刀，镊子，大号培养皿，滤纸等。
1.2 方法
1.2.1 外植体处理 嫩叶、叶柄、茎节处理：将离体的外植体用流水冲洗干净后以洗衣粉浸泡30 min，洗净。在超净工作台上用无菌水冲洗2遍后75%酒精漂洗8s，无菌水冲洗4遍，0.1%升汞浸泡30 min后用无菌水冲洗6遍。在无菌滤纸上将无菌嫩叶切成0.5㎝×0.5㎝小块（叶柄、茎切段1.0㎝）备用。子房获取：将离体的北沙参花絮洗净消毒完全后，在解剖镜下用镊子和手术刀拨开小花被，剖取子房。
将准备好的外植体分别接种到培养基上。每个处理接种5瓶，每瓶接种8个外植体，每处理总数40个外植体。在温度（25±3）℃，光照12hd1，光照强度为1000～1500lx的培养室中培养。每2天进培养室观察材料生长情况，及时转接处理污染材料，以便数据统计。培养45天后统一计算出愈率。
1.2.2愈伤组织诱导激素水平处理 北沙参愈伤组织诱导实验采用L9（34）正交设计法[]，以6BA 、NAA、2,4D质量溶度为参考因素，每种激素设置3个水平，见表1所示。
表1 北沙参愈伤组织诱导的激素水平
Tab 1 the Level and Factor of Hormones for Inducing Callus of Glehnia Littoralis
水平
Level
因素
Factor
6BA/ mg/L
NAA/ mg/L
2,4D/ mg/L
1
1
0.1
0.1
2
1.5
0.2
0.2
3
2.0
0.3
0.3
根据L9（34）表设计9组不同处理的激素诱导体系，考察三种不同激素对北沙参愈伤组织诱导的影响[]。基本培养基为MS调PH5.8，琼脂为7 g/L。北沙参愈伤组织诱导培养基配比正交实验设计表见下表2所示：
表2 北沙参愈伤组织诱导3因素3水平正交实验设计
Tab2 Orthogonal Experimental Design for Callus Induction of Glehnia Littoralis
编号
No.
培养基配方／mg/L
Treatment / mg/L
6BA NAA 2，4D
B1
1.0 0.1 0.1
B2
1.0 0.2 0.2
B3
1.0 0.3 0.3
B4
1.5 0.2 0.3
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