芹菜品种‘六合黄心芹’agccoaomt基因的克隆及表达特性分析
根据伞形科（Apiaceae）植物芹菜（Apium graveolens Linn.）的转录组数据库，从芹菜品种‘六合黄心芹’（‘Liuhe Huangxinqin’）叶片总RNA中克隆获得咖啡碱-辅酶A-O-甲基转移酶基因，命名为AgCCoAOMT基因。序列分析结果表明AgCCoAOMT基因包含1个长度726 bp的开放阅读框（ORF），其编码的蛋白质为AgCCoAOMT，属于AdoMet_MTase超级家族。多重比对和系统树分析结果表明AgCCoAOMT蛋白有较高的保守性。qRT-PCR检测结果表明AgCCoAOMT基因能够在‘六合黄心芹’的根、茎、叶柄和叶片中表达，且叶片中的相对表达量极显著（P<0.01）高于其他组织。其在商品期（播种后65天）的相对表达量极显著高于幼苗期（播种后25天）和生长旺盛期（播种后第45天）。结果显示AgCCoAOMT基因与‘六合黄心芹’叶的老化和木质素含量升高有关，且在进化过程中具有较高的保守性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1总RNA提取及cDNA的合成2
1.2.2目的基因克隆3
1.2.3序列分析3
1.2.4基因表达特性分析3
2结果和分析3
2.1目的基因的克隆及序列分析结果3
2.2 AgCCoAOMT蛋白与不同植物CCoAOMT蛋白的比较5
2.2.1氨基酸序列同源性分析5
2.2.2蛋白质理化性质及氨基酸组成分析6
2.2.3系统进化分析7
2.3 AgCCoAOMT蛋白的三级结构预测及分析7
2.4 ‘六合黄心芹’AgCCoAOMT基因的表达特性分析8
2.4.1在不同组织中的表达特性分析8
2.4.2在不同生长发育阶段的表达特性分析8
3讨论9
致谢9
参考文献9
图1 芹菜品种‘六合黄心芹’AgCCoAOMT基因的PCR扩增结果4
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
图2 芹菜品种‘六合黄心芹’AgCCoAOMT基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列5
图3 芹菜品种‘六合黄心芹’AgCCoAOMT蛋白的保守域预测结果5
图4 芹菜品种‘六合黄心芹’AgCCoAOMT蛋白氨基酸序列的亲水性（A）和疏水性（B）分析结果5
图5 芹菜品种‘六合黄心芹’、茶树和枇杷的CCoAOMT蛋白氨基酸序列的多重比对结果6
图6 芹菜品种‘六合黄心芹’及其他植物CCoAOMT蛋白的系统树7
图7 芹菜品种‘六合黄心芹’AgCCoAOMT蛋白的三级结构8
图8 芹菜品种‘六合黄心芹’不同组织（A）和不同生长发育阶段叶片（B）中AgCCoAOMT基因相对表达量的比较AgCCoAOMT蛋白的三级结构8
表1 芹菜品种‘六合黄心芹’及其他植物CCoAOMT蛋白的氨基酸组成和理化性质比较6 芹菜品种‘六合黄心芹’ AgCCoAOMT基因的克隆及表达特性分析
引言
膳食纤维包括纤维素、木质素、低聚糖和果胶等[1]。摄入适量的膳食纤维有益于人类的身体健康[23]。木质素可参与构成植物细胞壁，其积累能够提高细胞壁的硬度，使蔬菜组织木质化，进而影响蔬菜的口感和品质[4]。木质素由木质素单体聚合而成，它是一种芳香类的物质。木质素中包括3种木质素单体，直至现在，没有办法可以分离出原木质素[5]。木质素单体主要分为：由香豆醇衍生的对苯基单体（H型）、由松柏醇衍生的愈创木基单体（G型）和由芥子醇衍生的紫丁香基单体（S型）三类[6]。目前，有关木质素的研究及应用多涉及木材和造纸[78]、能源[9]和饲料[1011]等方面，而对蔬菜中木质素的相关研究报道尚不多见。
咖啡碱辅酶AO甲基转移酶（caffeoylCoAOmethyltransferase，CCoAOMT）为木质素合成过程中起关键作用的一类甲基转移酶（methyltransferases，MTs）[1213]，参与植物的木质化进程[14]。在木质素生物合成中，CCoAOMT可催化咖啡酰CoA甲基化生成阿魏酰CoA[15]，并促进复杂的甲基化次生代谢反应，参与不同的生物反应过程[1618]。目前，已经从多种植物中分离获得CCoAOMT基因[1922]，并发现反义抑制CCoAOMT基因后，细胞中的木质素含量明显降低，且S型和G型木质素含量同时降低，其中G型木质素含量降幅较大，导致S/G的比值增加[2325]。此外，有研究表明植物中的CCoAOMT还能够响应逆境胁迫[22,26]。
芹菜（Apium graveolens Linn.）为伞形科（Apiaceae）一、二年生草本植物，是中国和全世界重要叶菜类蔬菜作物之一，富含胡萝卜素、维生素和纤维素等，兼具食用和药用价值[27]。芹菜中的含钙量是蔬菜中最高的，每100g芹菜中含钙量高达152mg。芹菜中含有的芹菜碱，具有降压安神的作用。芹菜可降低蛋白质糖化，所以，糖尿病患者适合经常食用[28]。然而，在科学研究中，相对其他模式植物和园艺作物而言，有关芹菜分子生物学方面的研究报道较少[2931]，Pakusch等[32]和Schmitt等[33]均发现伞形科蔬菜作物的细胞培养液中存在CCoAOMT，但对芹菜中CCoAOMT基因及其与木质素合成的关系尚不清楚，在芹菜对逆境胁迫的响应过程中，该基因的作用也未可知。
产自江苏省南京市六合区的优良芹菜品种‘六合黄心芹’（‘Liuhe Huangxinqin’）具有喜湿、耐肥、耐热和耐寒等特点[34]，本研究以该品种为实验材料，克隆获得其CCoAOMT基因，对该基因及其编码的氨基酸序列进行分析和比较；并采用qRTPCR技术检测该基因在不同组织中和不同生长发育阶段叶片的表达特性，以期为深入研究在芹菜木质素代谢中的作用奠定研究基础，为芹菜品质改良研究提供基础数据。
1 材料与方法
1．1 材料
于2016年5月，将经过催芽的‘六合黄心芹’种子播种到穴盘中，置于大学作物遗传与种质创新国家重点实验室的人工气候室内进行培养，培养条件为：光照时间16 hd1、昼温25 ℃、夜温18 ℃、光照强度300 μmolm2s1。在播种后第25天采6集嫩叶，经液氮速冻后置于80 ℃冰箱中保存，用于提取总的RNA。在播种后第25天（幼苗期）、第45天（生长旺盛期）和第65天（商品期），分别采集植株叶片，采用前述方法速冻和保存，用于不同发育阶段的基因表达分析；在播种后第65天分别采集植株的根、茎、叶柄和叶片，每份样品1g，重复三次进行取样。采用前述方法速冻和保存，用于不同组织的基因表达分析，即用于实时荧光定量PCR。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1总RNA提取及cDNA的合成2
1.2.2目的基因克隆3
1.2.3序列分析3
1.2.4基因表达特性分析3
2结果和分析3
2.1目的基因的克隆及序列分析结果3
2.2 AgCCoAOMT蛋白与不同植物CCoAOMT蛋白的比较5
2.2.1氨基酸序列同源性分析5
2.2.2蛋白质理化性质及氨基酸组成分析6
2.2.3系统进化分析7
2.3 AgCCoAOMT蛋白的三级结构预测及分析7
2.4 ‘六合黄心芹’AgCCoAOMT基因的表达特性分析8
2.4.1在不同组织中的表达特性分析8
2.4.2在不同生长发育阶段的表达特性分析8
3讨论9
致谢9
参考文献9
图1 芹菜品种‘六合黄心芹’AgCCoAOMT基因的PCR扩增结果4
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
图2 芹菜品种‘六合黄心芹’AgCCoAOMT基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列5
图3 芹菜品种‘六合黄心芹’AgCCoAOMT蛋白的保守域预测结果5
图4 芹菜品种‘六合黄心芹’AgCCoAOMT蛋白氨基酸序列的亲水性（A）和疏水性（B）分析结果5
图5 芹菜品种‘六合黄心芹’、茶树和枇杷的CCoAOMT蛋白氨基酸序列的多重比对结果6
图6 芹菜品种‘六合黄心芹’及其他植物CCoAOMT蛋白的系统树7
图7 芹菜品种‘六合黄心芹’AgCCoAOMT蛋白的三级结构8
图8 芹菜品种‘六合黄心芹’不同组织（A）和不同生长发育阶段叶片（B）中AgCCoAOMT基因相对表达量的比较AgCCoAOMT蛋白的三级结构8
表1 芹菜品种‘六合黄心芹’及其他植物CCoAOMT蛋白的氨基酸组成和理化性质比较6 芹菜品种‘六合黄心芹’ AgCCoAOMT基因的克隆及表达特性分析
引言
膳食纤维包括纤维素、木质素、低聚糖和果胶等[1]。摄入适量的膳食纤维有益于人类的身体健康[23]。木质素可参与构成植物细胞壁，其积累能够提高细胞壁的硬度，使蔬菜组织木质化，进而影响蔬菜的口感和品质[4]。木质素由木质素单体聚合而成，它是一种芳香类的物质。木质素中包括3种木质素单体，直至现在，没有办法可以分离出原木质素[5]。木质素单体主要分为：由香豆醇衍生的对苯基单体（H型）、由松柏醇衍生的愈创木基单体（G型）和由芥子醇衍生的紫丁香基单体（S型）三类[6]。目前，有关木质素的研究及应用多涉及木材和造纸[78]、能源[9]和饲料[1011]等方面，而对蔬菜中木质素的相关研究报道尚不多见。
咖啡碱辅酶AO甲基转移酶（caffeoylCoAOmethyltransferase，CCoAOMT）为木质素合成过程中起关键作用的一类甲基转移酶（methyltransferases，MTs）[1213]，参与植物的木质化进程[14]。在木质素生物合成中，CCoAOMT可催化咖啡酰CoA甲基化生成阿魏酰CoA[15]，并促进复杂的甲基化次生代谢反应，参与不同的生物反应过程[1618]。目前，已经从多种植物中分离获得CCoAOMT基因[1922]，并发现反义抑制CCoAOMT基因后，细胞中的木质素含量明显降低，且S型和G型木质素含量同时降低，其中G型木质素含量降幅较大，导致S/G的比值增加[2325]。此外，有研究表明植物中的CCoAOMT还能够响应逆境胁迫[22,26]。
芹菜（Apium graveolens Linn.）为伞形科（Apiaceae）一、二年生草本植物，是中国和全世界重要叶菜类蔬菜作物之一，富含胡萝卜素、维生素和纤维素等，兼具食用和药用价值[27]。芹菜中的含钙量是蔬菜中最高的，每100g芹菜中含钙量高达152mg。芹菜中含有的芹菜碱，具有降压安神的作用。芹菜可降低蛋白质糖化，所以，糖尿病患者适合经常食用[28]。然而，在科学研究中，相对其他模式植物和园艺作物而言，有关芹菜分子生物学方面的研究报道较少[2931]，Pakusch等[32]和Schmitt等[33]均发现伞形科蔬菜作物的细胞培养液中存在CCoAOMT，但对芹菜中CCoAOMT基因及其与木质素合成的关系尚不清楚，在芹菜对逆境胁迫的响应过程中，该基因的作用也未可知。
产自江苏省南京市六合区的优良芹菜品种‘六合黄心芹’（‘Liuhe Huangxinqin’）具有喜湿、耐肥、耐热和耐寒等特点[34]，本研究以该品种为实验材料，克隆获得其CCoAOMT基因，对该基因及其编码的氨基酸序列进行分析和比较；并采用qRTPCR技术检测该基因在不同组织中和不同生长发育阶段叶片的表达特性，以期为深入研究在芹菜木质素代谢中的作用奠定研究基础，为芹菜品质改良研究提供基础数据。
1 材料与方法
1．1 材料
于2016年5月，将经过催芽的‘六合黄心芹’种子播种到穴盘中，置于大学作物遗传与种质创新国家重点实验室的人工气候室内进行培养，培养条件为：光照时间16 hd1、昼温25 ℃、夜温18 ℃、光照强度300 μmolm2s1。在播种后第25天采6集嫩叶，经液氮速冻后置于80 ℃冰箱中保存，用于提取总的RNA。在播种后第25天（幼苗期）、第45天（生长旺盛期）和第65天（商品期），分别采集植株叶片，采用前述方法速冻和保存，用于不同发育阶段的基因表达分析；在播种后第65天分别采集植株的根、茎、叶柄和叶片，每份样品1g，重复三次进行取样。采用前述方法速冻和保存，用于不同组织的基因表达分析，即用于实时荧光定量PCR。
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