菊花脑离体再生植株研究
本试验以菊花脑叶片、茎表皮和种子为材料，通过添加多种生长调节剂组合诱导愈伤组织、不定芽分化与生根，构建菊花脑再生体系。结果表明，外植体类型和生长调节剂组合是影响不定芽再生的主要因素。叶片诱导出的愈伤难以分化不定芽；茎表皮的不定芽再生率最高为28.4%，最适愈伤培养基为MS+活性炭 (AC) 2.0 g·L-1+IBA 1.0 mg·L-1+6-BA 0.1 mg·L-1，最适再生培养基为MS+AC 2.0 g·L-1+TDZ 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1；种子的不定芽再生率最高为19.8%，最适愈伤培养基为MS+2,4-D 1.5 mg·L-1+6-BA 0.05 mg·L-1，最适再生培养基为MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1。最适于诱导不定芽生根的培养基为1/2MS+IBA 0.2 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1 +琼脂7.0 g·L-1。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
1材料与方法 3
1.1试验材料 3
1.2试验方法 3
1.2.1外植体消毒与无菌苗的获得3
1.2.2叶片、茎表皮愈伤诱导和不定芽再生培养基的选择3
1.2.3种子愈伤诱导和不定芽再生培养基的选择3
1.2.4生根培养基的选择与炼苗移栽3
2结果与分析3
2.1不同生长调节剂对叶片愈伤诱导和不定芽再生的影响3
2.2不同生长调节剂对茎表皮愈伤诱导和不定芽再生的影响4
2.3不同生长调节剂对种子愈伤诱导和不定芽再生的影响5
2.4 IBA对不定芽生根的影响及炼苗移栽6
3讨论与结论7
致谢7
附图8
参考文献9
附录C本科生毕业论文（设计）答辩及综合评分表12
菊花脑离体再生植株研究
引言
菊花（Chrysanthemum morifolium）在中国有三千多年的栽培历史，具有观赏、食用、药用等多种价值，深受国人喜爱。菊花品种繁多，染色体组成多样，对其重要性状 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
进行解析较为困难。菊花脑（C. nankingense）为菊科（Compositae）菊属（Chrysanthemum）多年生草本植物，属于二倍体，遗传背景较为简单且参与栽培菊的起源[1]，将其作为模式植物开展研究可为栽培菊的遗传育种提供理论依据。
目前国内外对菊花脑的报道多集中于生产技术[2]、成分分析[3]、遗传加倍[4,5]、种属间杂交[6,7]等方面，关于菊花脑组织培养的研究较少。有研究者以叶片、茎段和叶柄为外植体[8,9]，进行离体再生植株培养，但笔者在重复前人试验时发现已报道的再生体系不够稳定，再现性差。而高频稳定的再生系统是开展遗传转化研究的前提，因此有必要对菊花脑不同组织器官的再生能力进行系统研究。本研究以菊花脑叶盘、茎表皮和种子为外植体，研究了不同植物生长调节剂组合对愈伤诱导和不定芽分化的影响，旨在建立菊花脑稳定高效的再生体系，为菊花脑的遗传转化奠定基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
供试材料为二倍体菊花脑的脚芽和种子，取自大学“中国菊花种质资源保存中心”。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体消毒与无菌苗的获得
取生长健壮的菊花脑脚芽，洗涤液清洗表面尘土，流水冲洗20～30 min，在超净工作台上先用70%乙醇浸泡30 s，再用15%双氧水溶液浸泡4～5 min，无菌水冲洗5次。将脚芽切为2.0～3.0 cm，接种于不加任何激素的MS培养基，获得无菌苗。
取适量菊花脑种子置于1.5 ml离心管中，先用75%酒精浸泡1 min，再用1‰Triton X100与2%次氯酸钠混合液浸泡20 min，最后用无菌水洗涤4～5次。
培养条件为：温度22±1℃，湿度50%～60%，光照16 hd1，光照强度32～36 μmolm2s1（以下同）。
1.2.2 叶片、茎表皮愈伤诱导和不定芽再生培养基的选择
以30 d苗龄的菊花脑无菌苗为材料，将其上部嫩叶切为0.5 cm2左右的叶盘，从其幼嫩茎段上削取厚度为0.2～0.5 mm的表皮，分别接种至添加不同种类及浓度生长素的愈伤诱导培养基中（以MS+2 gL1AC为基本培养基，6BA浓度设置为0.1 mgL1，IBA、NAA和2,4D浓度设置为0.5、1.0、2.0 mgL1），20 d后统计愈伤率。挑选长势良好的愈伤，将其切分并转至不定芽再生培养基（以MS+2 gL1AC为基本培养基，NAA浓度设置为0.1 mgL1，TDZ、6BA和KT的浓度均设置为0.5、1.0、2.0 mgL1），30 d后统计再生率和平均芽数。愈伤诱导阶段每处理接种30个外植体，不定芽分化阶段每处理接种20个外植体，均重复三次。
1.2. 3 种子愈伤诱导和不定芽再生培养基的选择
将消毒后的菊花脑种子分别接种至添加不同种类及浓度生长素的愈伤诱导培养基中（以MS为基本培养基，6BA浓度设置为0.05 mgL1，NAA、2,4D浓度设置为0.5、1.0、1.5、2.0 mgL1），25 d后统计愈伤率。挑选长势良好的愈伤，将其切分并转至不定芽再生培养基（以MS为基本培养基，NAA浓度设置为0.05 mgL1，TDZ浓度设置为0.2、0.5、1.0、1.5 mgL1，6BA浓度设置为0.5、1.0、2.0、3.0 mgL1），40 d后统计再生率和平均芽数。愈伤诱导阶段每处理接种45个外植体，不定芽分化阶段每处理接种30个外植体，均重复三次。
1.2. 4 生根培养基的选择与炼苗移栽
切取生长健壮，长约2 cm的菊花脑不定芽，接种至生根培养基（以1/2MS为基本培养基，IBA浓度设置为0、0.05、0.1、0.2、0.3 mgL1）。20 d后统计生根率、平均根数和平均根长。每处理接种10个外植体，重复三次。
不定根在最适生根培养基中长至3～4 cm时，将瓶盖半开，加水炼苗。3 d后取出组培苗，洗净根部培养基，移栽至混合基质（泥炭：蛭石：珍珠岩=1：2：1）中，每日喷水保湿，15 d后统计成活率。
2 结果和分析
2.1 不同生长调节剂对叶片愈伤诱导和不定芽再生的影响
在NAA或IBA诱导下，叶盘接种1周后边缘扭曲膨大，形成黄绿色愈伤组织。在2,4D诱导下愈伤形成时间要推迟2～3 d。三种生长素均诱导出表面颗粒状，紧密，质地较硬的愈伤。由表1可知，在不同生长素诱导下叶盘愈伤率均为100%，褐化率差异显著。与同浓度的NAA和2,4D相比，IBA诱导出的愈伤量多，但褐化率最高，可能是愈伤的快速生长增加了酚类物质的合成，加剧褐化的产生。2.0 mgL12,4D诱导出的愈伤组织长势良好，褐化率最低为8.9%。因此，选择9号培养基中的愈伤，将其切分进行再生培养。
叶片愈伤组织转入再生培养基后继续膨大，表面无芽点形成。随着培养时间延长，愈伤逐渐老化褐化，30 d时不定芽再生率为0。
表1 不同浓度生长素对菊花脑叶片愈伤诱导的影响
处理
Treatment
生长调节剂浓度
Plant growth regulator concentrations（mgL1）
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
1材料与方法 3
1.1试验材料 3
1.2试验方法 3
1.2.1外植体消毒与无菌苗的获得3
1.2.2叶片、茎表皮愈伤诱导和不定芽再生培养基的选择3
1.2.3种子愈伤诱导和不定芽再生培养基的选择3
1.2.4生根培养基的选择与炼苗移栽3
2结果与分析3
2.1不同生长调节剂对叶片愈伤诱导和不定芽再生的影响3
2.2不同生长调节剂对茎表皮愈伤诱导和不定芽再生的影响4
2.3不同生长调节剂对种子愈伤诱导和不定芽再生的影响5
2.4 IBA对不定芽生根的影响及炼苗移栽6
3讨论与结论7
致谢7
附图8
参考文献9
附录C本科生毕业论文（设计）答辩及综合评分表12
菊花脑离体再生植株研究
引言
菊花（Chrysanthemum morifolium）在中国有三千多年的栽培历史，具有观赏、食用、药用等多种价值，深受国人喜爱。菊花品种繁多，染色体组成多样，对其重要性状 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
进行解析较为困难。菊花脑（C. nankingense）为菊科（Compositae）菊属（Chrysanthemum）多年生草本植物，属于二倍体，遗传背景较为简单且参与栽培菊的起源[1]，将其作为模式植物开展研究可为栽培菊的遗传育种提供理论依据。
目前国内外对菊花脑的报道多集中于生产技术[2]、成分分析[3]、遗传加倍[4,5]、种属间杂交[6,7]等方面，关于菊花脑组织培养的研究较少。有研究者以叶片、茎段和叶柄为外植体[8,9]，进行离体再生植株培养，但笔者在重复前人试验时发现已报道的再生体系不够稳定，再现性差。而高频稳定的再生系统是开展遗传转化研究的前提，因此有必要对菊花脑不同组织器官的再生能力进行系统研究。本研究以菊花脑叶盘、茎表皮和种子为外植体，研究了不同植物生长调节剂组合对愈伤诱导和不定芽分化的影响，旨在建立菊花脑稳定高效的再生体系，为菊花脑的遗传转化奠定基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
供试材料为二倍体菊花脑的脚芽和种子，取自大学“中国菊花种质资源保存中心”。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体消毒与无菌苗的获得
取生长健壮的菊花脑脚芽，洗涤液清洗表面尘土，流水冲洗20～30 min，在超净工作台上先用70%乙醇浸泡30 s，再用15%双氧水溶液浸泡4～5 min，无菌水冲洗5次。将脚芽切为2.0～3.0 cm，接种于不加任何激素的MS培养基，获得无菌苗。
取适量菊花脑种子置于1.5 ml离心管中，先用75%酒精浸泡1 min，再用1‰Triton X100与2%次氯酸钠混合液浸泡20 min，最后用无菌水洗涤4～5次。
培养条件为：温度22±1℃，湿度50%～60%，光照16 hd1，光照强度32～36 μmolm2s1（以下同）。
1.2.2 叶片、茎表皮愈伤诱导和不定芽再生培养基的选择
以30 d苗龄的菊花脑无菌苗为材料，将其上部嫩叶切为0.5 cm2左右的叶盘，从其幼嫩茎段上削取厚度为0.2～0.5 mm的表皮，分别接种至添加不同种类及浓度生长素的愈伤诱导培养基中（以MS+2 gL1AC为基本培养基，6BA浓度设置为0.1 mgL1，IBA、NAA和2,4D浓度设置为0.5、1.0、2.0 mgL1），20 d后统计愈伤率。挑选长势良好的愈伤，将其切分并转至不定芽再生培养基（以MS+2 gL1AC为基本培养基，NAA浓度设置为0.1 mgL1，TDZ、6BA和KT的浓度均设置为0.5、1.0、2.0 mgL1），30 d后统计再生率和平均芽数。愈伤诱导阶段每处理接种30个外植体，不定芽分化阶段每处理接种20个外植体，均重复三次。
1.2. 3 种子愈伤诱导和不定芽再生培养基的选择
将消毒后的菊花脑种子分别接种至添加不同种类及浓度生长素的愈伤诱导培养基中（以MS为基本培养基，6BA浓度设置为0.05 mgL1，NAA、2,4D浓度设置为0.5、1.0、1.5、2.0 mgL1），25 d后统计愈伤率。挑选长势良好的愈伤，将其切分并转至不定芽再生培养基（以MS为基本培养基，NAA浓度设置为0.05 mgL1，TDZ浓度设置为0.2、0.5、1.0、1.5 mgL1，6BA浓度设置为0.5、1.0、2.0、3.0 mgL1），40 d后统计再生率和平均芽数。愈伤诱导阶段每处理接种45个外植体，不定芽分化阶段每处理接种30个外植体，均重复三次。
1.2. 4 生根培养基的选择与炼苗移栽
切取生长健壮，长约2 cm的菊花脑不定芽，接种至生根培养基（以1/2MS为基本培养基，IBA浓度设置为0、0.05、0.1、0.2、0.3 mgL1）。20 d后统计生根率、平均根数和平均根长。每处理接种10个外植体，重复三次。
不定根在最适生根培养基中长至3～4 cm时，将瓶盖半开，加水炼苗。3 d后取出组培苗，洗净根部培养基，移栽至混合基质（泥炭：蛭石：珍珠岩=1：2：1）中，每日喷水保湿，15 d后统计成活率。
2 结果和分析
2.1 不同生长调节剂对叶片愈伤诱导和不定芽再生的影响
在NAA或IBA诱导下，叶盘接种1周后边缘扭曲膨大，形成黄绿色愈伤组织。在2,4D诱导下愈伤形成时间要推迟2～3 d。三种生长素均诱导出表面颗粒状，紧密，质地较硬的愈伤。由表1可知，在不同生长素诱导下叶盘愈伤率均为100%，褐化率差异显著。与同浓度的NAA和2,4D相比，IBA诱导出的愈伤量多，但褐化率最高，可能是愈伤的快速生长增加了酚类物质的合成，加剧褐化的产生。2.0 mgL12,4D诱导出的愈伤组织长势良好，褐化率最低为8.9%。因此，选择9号培养基中的愈伤，将其切分进行再生培养。
叶片愈伤组织转入再生培养基后继续膨大，表面无芽点形成。随着培养时间延长，愈伤逐渐老化褐化，30 d时不定芽再生率为0。
表1 不同浓度生长素对菊花脑叶片愈伤诱导的影响
处理
Treatment
生长调节剂浓度
Plant growth regulator concentrations（mgL1）
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