萝卜游离小孢子培养体系关键因素
本试验以12份萝卜品种为试验材料，在初步分析基因型对小孢子培养的影响基础上，以出胚率相对较高的萝卜品种W23为试材，通过花蕾预冷处理、悬浮小孢子预冷处理，不同浓度的NAA、IBA、外界温度对组培苗生根的影响，优化萝卜游离小孢子培养技术。结果表明，不同基因型植株花蕾小孢子出胚率不同，花蕾预冷处理未促进小孢子的出胚率，只是暂时起到保存花蕾的作用；悬浮小孢子遇冷处理1d可促进萝卜出胚。在10℃温度下，固体培养基中加入0.15mg/L NAA，是萝卜生根的理想条件。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1试验材料 2
1.2试验方法 2
1.2.1培养基的配制2
1.2.2小孢子悬浮游离培养过程2
1.2.3花蕾4℃预冷处理对游离小孢子诱导胚状体产生的影2
1.2.4悬浮小孢子4℃预冷处理对游离小孢子诱导胚状体产生的影3
1.2.5不同浓度的激素（NAA，IBA）处理以及温度对继代生根的影响3
2结果与分析3
2.1基因型对小孢子出胚的影响3
2.2花蕾和悬浮小孢子的预冷处理对小孢子出胚的影响4
2.3不同浓度NAA和IBA对小孢子组培苗生根率的影响6
2.4不同外界温度对小孢子组培苗生根率的影响6
3结论7
致谢8
参考文献8
附录9
萝卜游离小孢子培养体系关键因素
引言
引言：萝卜(Raphanus sativus L.)是十字花科萝卜属一、二年生草本植物，营养价值丰富，药用价值高[1]。同时也是典型的十字花科雌雄同花的异花授粉作物，遗传变异大，杂种优势十分明显，多代自交易出现黄化现象，经济性状退化严重，杂种优势育种自交系的纯化时间较长，因此育种周期较长。游离小孢子培养技术是快速获得纯合自交系的一个途径，它可快速获得单倍体植株,自然加倍或人工加倍后成为纯合自交系，缩短育种进程,在国内外已得到广泛的应用。 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
Lichter 首次报道获得甘蓝型油菜小孢子培养植株[2]，并首先用萝卜游离小孢子诱导出了胚状体[3]；1996年Yoshihito对11个萝卜基因型进行游离小孢子培养，其中6个基因型获得了胚状体[4]；周志国在19个萝卜品种中的13基因型诱导出了胚状体，其中8个基因型获得了再生植株[5]。虽然很多学者报道了萝卜小孢子培养技术研究，但由于受到试验所用基因型的制约，尚未能规模化应用于实际育种。尤其是在萝卜小孢子培养方面，对于小孢子组培苗生根培养基激素的添加以及生根的温度条件的研究比较少。
因此，本试验以12份萝卜基因型为试材，在筛选易于小孢子培养的基因型基础上，选择出胚率较高的萝卜品种W23进行花蕾的预冷处理、悬浮小孢子预冷处理以及生根所需的NAA、IBA浓度和外界温度条件，比较并优化萝卜游离小孢子培养技术。
1 材料与方法
1.1试验材料
实验室保存的萝卜品种共计12份（W1、W2、W4、W6、W11、W16、W17、W18、W22、W23、W30、W38），春季取处于盛花期植株的花蕾进行小孢子培养。
从供体植株上选取饱满花蕾，每个基因型各选取50个适宜小孢子培养大小（3.0~4.0 mm[6]）的花蕾，醋酸洋红染色压片法镜检小孢子发育时期，选取大多数处于单核靠边期的花蕾进行游离小孢子培养，三周后观察统计出胚情况。
1.2 试验方法
1．2．1 培养基的配制
配制B5提取缓冲液：不含激素的BS培养基，13%蔗糖，pH5.8，121 ℃高压灭菌，置于4 ℃冰箱中备用。
NLN13液体培养基：NLN基本培养基改良的Nitseh培养基[2]，不含激素，13%蔗糖，pH 5.8，0.2 μm滤膜过滤除菌。
1．2．2 小孢子悬浮游离培养过程
选择适宜大小的花蕾后，首先用75%的酒精灭菌30 s左右，然后用7%的次氯酸钠消毒浸泡15 min，再用无菌水冲洗3次，每次5 min，然后把花蕾用镊子转入灭过菌的研钵中，加入B5提取液2~3 ml，用研棒轻轻挤压后，倒入45 μm孔径的尼龙筛网过滤，用15 ml离心管收集滤液，再加入少量B5到尼龙网中，充分冲洗，后900 r/min离心3次，每次5 min，离心后加入NLN来调节浓度，最终浓度达到1x105 ml1，放入小烧杯中，加入1%活性炭，分装到小培养皿中，石蜡封口膜封口，平均每皿加入2~3 ml。在33 ℃光照培养箱中暗培养24 h（热激处理），后置于25 ℃继续暗培养，三周后观察胚状体的生长状况[5]。
1．2．3 花蕾4℃预冷处理对游离小孢子诱导胚状体产生的影响
从田间取来的花蕾，放入三角瓶中，放入少量蒸馏水，以处理天数进行分类，放在4 ℃冰箱进行花蕾预冷处理，处理天数为0d、1d、2d、3d，重复3次，观察小孢子的出胚数量。
1．2．4 悬浮小孢子4℃预冷处理对游离小孢子诱导胚状体产生的影响
把分装在培养皿中悬浮在液体NLN培养基[2]中的小孢子放在4 ℃的冰箱进行预冷处理，处理时间为0d、1d、2d、3d，重复3次，观察小孢子的出胚数量。
1．2．5 不同浓度的激素（NAA，IBA）处理以及温度对继代生根的影响
将培养获得的萝卜无根小孢子组培苗转移到含有0~0.3 mg/L浓度的NAA的1/2MS培养基中，找到适合萝卜组培苗生根的适宜条件；IBA也是一种促进生根的激素，它可以促进植物主根生长，提高发芽率和成活率，用于促进插条生根，因此本实验还在1/2MS+0.15 mg/LNAA培养基的基础上添加了0~0.2 mg/L浓度的IBA进行实验；然后，在不同的外界处理温度下，找到适合小孢子组培苗生根的有利温度。
2 结果与分析
2.1基因型对小孢子出胚的影响
供试的12个萝卜品种中只有W1、W2、W17和W23四个基因型获得了胚状体，其余的8个品种未见胚状体的产生（见表1），由此可以看出基因型是限制萝卜出胚率的关键因素，与前人研究一致。萝卜品种W23胚状体诱导率最高（见图2）。
图1 萝卜游离小孢子胚胎发生
A、B：胚状体，C：子叶型胚转绿，D：胚状体转入再生培养基，E：胚状体诱导愈伤组织，F：再生植株
Fig. 1 Microspore embryogenesis of radish
A, B: Embryos; C: Embryo turning green; D: Embryo transferred into regeneration medium; E: Callus induced from embryo; F: Regenerated plantlets
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1试验材料 2
1.2试验方法 2
1.2.1培养基的配制2
1.2.2小孢子悬浮游离培养过程2
1.2.3花蕾4℃预冷处理对游离小孢子诱导胚状体产生的影2
1.2.4悬浮小孢子4℃预冷处理对游离小孢子诱导胚状体产生的影3
1.2.5不同浓度的激素（NAA，IBA）处理以及温度对继代生根的影响3
2结果与分析3
2.1基因型对小孢子出胚的影响3
2.2花蕾和悬浮小孢子的预冷处理对小孢子出胚的影响4
2.3不同浓度NAA和IBA对小孢子组培苗生根率的影响6
2.4不同外界温度对小孢子组培苗生根率的影响6
3结论7
致谢8
参考文献8
附录9
萝卜游离小孢子培养体系关键因素
引言
引言：萝卜(Raphanus sativus L.)是十字花科萝卜属一、二年生草本植物，营养价值丰富，药用价值高[1]。同时也是典型的十字花科雌雄同花的异花授粉作物，遗传变异大，杂种优势十分明显，多代自交易出现黄化现象，经济性状退化严重，杂种优势育种自交系的纯化时间较长，因此育种周期较长。游离小孢子培养技术是快速获得纯合自交系的一个途径，它可快速获得单倍体植株,自然加倍或人工加倍后成为纯合自交系，缩短育种进程,在国内外已得到广泛的应用。 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
Lichter 首次报道获得甘蓝型油菜小孢子培养植株[2]，并首先用萝卜游离小孢子诱导出了胚状体[3]；1996年Yoshihito对11个萝卜基因型进行游离小孢子培养，其中6个基因型获得了胚状体[4]；周志国在19个萝卜品种中的13基因型诱导出了胚状体，其中8个基因型获得了再生植株[5]。虽然很多学者报道了萝卜小孢子培养技术研究，但由于受到试验所用基因型的制约，尚未能规模化应用于实际育种。尤其是在萝卜小孢子培养方面，对于小孢子组培苗生根培养基激素的添加以及生根的温度条件的研究比较少。
因此，本试验以12份萝卜基因型为试材，在筛选易于小孢子培养的基因型基础上，选择出胚率较高的萝卜品种W23进行花蕾的预冷处理、悬浮小孢子预冷处理以及生根所需的NAA、IBA浓度和外界温度条件，比较并优化萝卜游离小孢子培养技术。
1 材料与方法
1.1试验材料
实验室保存的萝卜品种共计12份（W1、W2、W4、W6、W11、W16、W17、W18、W22、W23、W30、W38），春季取处于盛花期植株的花蕾进行小孢子培养。
从供体植株上选取饱满花蕾，每个基因型各选取50个适宜小孢子培养大小（3.0~4.0 mm[6]）的花蕾，醋酸洋红染色压片法镜检小孢子发育时期，选取大多数处于单核靠边期的花蕾进行游离小孢子培养，三周后观察统计出胚情况。
1.2 试验方法
1．2．1 培养基的配制
配制B5提取缓冲液：不含激素的BS培养基，13%蔗糖，pH5.8，121 ℃高压灭菌，置于4 ℃冰箱中备用。
NLN13液体培养基：NLN基本培养基改良的Nitseh培养基[2]，不含激素，13%蔗糖，pH 5.8，0.2 μm滤膜过滤除菌。
1．2．2 小孢子悬浮游离培养过程
选择适宜大小的花蕾后，首先用75%的酒精灭菌30 s左右，然后用7%的次氯酸钠消毒浸泡15 min，再用无菌水冲洗3次，每次5 min，然后把花蕾用镊子转入灭过菌的研钵中，加入B5提取液2~3 ml，用研棒轻轻挤压后，倒入45 μm孔径的尼龙筛网过滤，用15 ml离心管收集滤液，再加入少量B5到尼龙网中，充分冲洗，后900 r/min离心3次，每次5 min，离心后加入NLN来调节浓度，最终浓度达到1x105 ml1，放入小烧杯中，加入1%活性炭，分装到小培养皿中，石蜡封口膜封口，平均每皿加入2~3 ml。在33 ℃光照培养箱中暗培养24 h（热激处理），后置于25 ℃继续暗培养，三周后观察胚状体的生长状况[5]。
1．2．3 花蕾4℃预冷处理对游离小孢子诱导胚状体产生的影响
从田间取来的花蕾，放入三角瓶中，放入少量蒸馏水，以处理天数进行分类，放在4 ℃冰箱进行花蕾预冷处理，处理天数为0d、1d、2d、3d，重复3次，观察小孢子的出胚数量。
1．2．4 悬浮小孢子4℃预冷处理对游离小孢子诱导胚状体产生的影响
把分装在培养皿中悬浮在液体NLN培养基[2]中的小孢子放在4 ℃的冰箱进行预冷处理，处理时间为0d、1d、2d、3d，重复3次，观察小孢子的出胚数量。
1．2．5 不同浓度的激素（NAA，IBA）处理以及温度对继代生根的影响
将培养获得的萝卜无根小孢子组培苗转移到含有0~0.3 mg/L浓度的NAA的1/2MS培养基中，找到适合萝卜组培苗生根的适宜条件；IBA也是一种促进生根的激素，它可以促进植物主根生长，提高发芽率和成活率，用于促进插条生根，因此本实验还在1/2MS+0.15 mg/LNAA培养基的基础上添加了0~0.2 mg/L浓度的IBA进行实验；然后，在不同的外界处理温度下，找到适合小孢子组培苗生根的有利温度。
2 结果与分析
2.1基因型对小孢子出胚的影响
供试的12个萝卜品种中只有W1、W2、W17和W23四个基因型获得了胚状体，其余的8个品种未见胚状体的产生（见表1），由此可以看出基因型是限制萝卜出胚率的关键因素，与前人研究一致。萝卜品种W23胚状体诱导率最高（见图2）。
图1 萝卜游离小孢子胚胎发生
A、B：胚状体，C：子叶型胚转绿，D：胚状体转入再生培养基，E：胚状体诱导愈伤组织，F：再生植株
Fig. 1 Microspore embryogenesis of radish
A, B: Embryos; C: Embryo turning green; D: Embryo transferred into regeneration medium; E: Callus induced from embryo; F: Regenerated plantlets
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