不同激素配比对粳稻愈伤组织继代的影响
目 录
1 引言 1
1.1 水稻的转基因 1
1.2 水稻愈伤组织培养.1
1.3 悬浮细胞培养..
2 材料与方法 2
2.1 供试材料 2
2.2 培养基 3
2.3 器具和培养基处理 3
2.4 培养条件及继代 3
2.5 结果观察与统计结果 4
3 结果与分析 4
3.1不同2,4-D对不同粳稻品种愈伤组织继代的影响 4
3.2不同浓度6-BA对不同粳稻品种愈伤组织继代的影响 7
3.3不同浓度配比（2,4-D/6-BA）对不同粳稻品种愈伤组织继代的影响 9
4 讨论 13
结论 16
致谢 17
参考文献18
1 引言
水稻作为拥有世界上超过三分之一人口所需要的主要粮食作物，正随着世界人口的增长、社会经济的发展，受到来自于病虫害、环境污染、旱涝等越来越多不利因素的约束，从而影响了水稻的高产。面对这些问题，国内外学者都积极利用围绕水稻的重要性状开展水稻育种等工作。水稻生物技术是其中一个重要的手段，在水稻育种中发挥越来越重要的作用。特别随着水稻基因测序的完成，在基因水平上改良水稻优良性状成为可能，转基因技术也成为揭示水稻基因功能的关键技术。随着二代测序技术的兴起，各种水稻生物技术手段，包括成熟胚的培养，基因的转化以及利用悬浮细胞体系在细胞学水平上揭示其生理功能等也在生物科学中被广泛运用。
1.1 水稻的转基因
在已经过去的大半个世纪里，水稻育种获得了巨大的收获，并且完成了两次比较大的突破。首先是20 世纪6 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
0年代开始的矮秆品种水稻的培育和应用不但提高了收获指数，而且大幅增加了产量潜力；其二是大约10年后开始的杂交稻的培育与推广，使产量在矮秆优良品种的基础上又大幅度增长[1-2]。
在实践中一些常规的育种方法因为周期长，不易获得好的优良品种等，所以基因工程的兴起使作物育种有了新的方向。其中转基因技术对作物育种影响非常深。1996年至2012年，全球的转基因种植面积就从170万公顷增加到1.7亿公顷，在这16年的时间里整整增加了100倍[3]。转基因的研究中Rong 等 [4-5] 的水稻基因飘流率结果为0.04%—0.79%；Chun 等 [6] 研究了抗除草剂水稻的基因飘流率结果为 0.039%[7]。水稻生产过程中，不仅病害会影响水稻的产量和质量，不利的天气和土壤等环境条件也是影响因素之一。所以水稻转基因的应用中如抗虫性转基因，抗病性转基因，抗逆性转基因等都可以改变这些。
首先，虽然转基因技术在未来有很大发展前景，但是技术上还有待改进。其次，在转基因水稻研究上，可利用基因资源的缺乏限制了转基因水稻的新品种的培育。再次，目前转基因技术取得的成果不是很理想，仍然限制着复杂性状的改良。
1.2 水稻愈伤组织培养
植物的组织培养指在人工控制的无菌环境条件下，利用适宜的培养基对离体的植物器官、组织、细胞等进行培养，使它们再生细胞或完整植株的技术[8]。
水稻的基因组很小，通过组织培养技术容易得到再生植株，它获得转基因植株的最好来源是生长和分裂旺盛的胚性愈伤组织。水稻品种改良的重要手段是遗传转化，也是基因克隆不能缺少的步骤，而遗传转化的前提是建立成熟的组织培养和再生体系[9]。近年来，水稻遗传转化的受体有愈伤组织、幼穗、幼胚等，并且各个部位都能诱导出愈伤组织和再生植株，可是幼穗和幼胚容易受季节的限制和在操作中被污染，所以一般都会先由各受体诱导得到愈伤组织，再进行遗传转化，这些都取得了较大的进展。
至今愈伤组织培养被广泛用于水稻育种研究，同时也创造了新的种质资源。水稻的组织培养已在单倍体育种、诱变育种、体细胞杂交及遗传转化等方面得到应用[10]。
1.3 悬浮细胞培养
水稻悬浮细胞有很多优点，比如繁殖速度快、颗粒均一、操作方便等，因此被认为是水稻转基因的理想受体之一[11]。1995年时,在水稻悬浮培养方面，我国的研究者林拥军等人在已有的悬浮细胞体系(杨金水等1979；赵成章等 1981；叶和春1984)基础上建立了许多水稻品种的悬浮细胞系[12]。经过愈伤组织的悬浮振荡培养，游离出单细胞，再用酶法游离原生质体。这一点可以解决转基因工程中资源限制的不足。
但是在悬浮细胞培养之前，首先要进行继代培养，以此培养出具有胚性的，颗粒大小均一，符合悬浮细胞培养要求的愈伤组织细胞。继代过程中，外植体褐化现象很普遍，褐化轻的影响生长发育，重的可以导致植株死亡。而导致褐化的因素有很多，比如操作手法不当、环境的改变、各种激素的影响等。本文研究继代时，不同激素配比对水稻愈伤组织的影响，以找出褐化率相对较少的配方。
2 材料与方法
2.1 供试材料
高表达玉米C4型光合酶基因pepc(PC)水稻和未转该基因的野生型Kitaake（WT）所诱导出来的愈伤组织。
2.2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
培养基
以M8为基本培养基（大量元素、微量元素、铁盐、氯化钙和有机成分），一次继代的主要配方如表1，前6个处理添加2,4-D浓度为1mg/L和1.5mg/L，6-BA浓度设置为0.2mg/L、0.4mg/L和0.5mg/L。处理7、8配方以1.5mg/L2,4-D为主，分别多添加了ABA和KT，pH值调到5.9-6.0。二次继代的主要处理配方如表2，A和B处理继续对第一次继代培养的处理1和2的配方进行培养，C和D配方继续对第一次继代培养其他6个处理配方继代培养的愈伤组织进行第二次继代，pH值调到5.9-6.0[13-15]。
表1 一次继代培养的水稻愈伤组织配方设置
处理 培养基配方（以下每个配方中每升培养基中添加30克蔗糖，8.5克琼脂）
1 2 3 4 5 6 7 8 M8+1mg/L2,4-D+0.2mg/L6-BA M8+1mg/L2,4-D+0.4mg/L6-BA M8+1mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA M8+1.5mg/L2,4-D+0.2mg/L6-BA M8+1.5mg/L2,4-D+0.4mg/L6-BA M8+1.5mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA M8+1.5mg/L2,4-D+1.5mg/L6-BA+1mg/LABA M8+1.5mg/L2,4-D+1mg/L6-BA+0.3mg/LKT
14天 1 75 9.33 70.67 生长比较快，颗粒状较多，黄色
4 85 5.88 70.59 生长快，颗粒多，黄色，分化快
2 80 16.25 58.75 生长慢，颗粒状少，褐化严重，分化少
5 80 13.75 61.25 生长较快，颗粒少，褐化较多
3 80 20.00 80.00 生长慢，干燥，有少数偏白，褐化多
通过控制2,4-D的浓度，观察不同6-BA浓度下水稻愈伤组织的褐化率情况（表5）。
6 80 12.50 87.50 生长略慢，偏干燥，黄色，分化
1 引言 1
1.1 水稻的转基因 1
1.2 水稻愈伤组织培养.1
1.3 悬浮细胞培养..
2 材料与方法 2
2.1 供试材料 2
2.2 培养基 3
2.3 器具和培养基处理 3
2.4 培养条件及继代 3
2.5 结果观察与统计结果 4
3 结果与分析 4
3.1不同2,4-D对不同粳稻品种愈伤组织继代的影响 4
3.2不同浓度6-BA对不同粳稻品种愈伤组织继代的影响 7
3.3不同浓度配比（2,4-D/6-BA）对不同粳稻品种愈伤组织继代的影响 9
4 讨论 13
结论 16
致谢 17
参考文献18
1 引言
水稻作为拥有世界上超过三分之一人口所需要的主要粮食作物，正随着世界人口的增长、社会经济的发展，受到来自于病虫害、环境污染、旱涝等越来越多不利因素的约束，从而影响了水稻的高产。面对这些问题，国内外学者都积极利用围绕水稻的重要性状开展水稻育种等工作。水稻生物技术是其中一个重要的手段，在水稻育种中发挥越来越重要的作用。特别随着水稻基因测序的完成，在基因水平上改良水稻优良性状成为可能，转基因技术也成为揭示水稻基因功能的关键技术。随着二代测序技术的兴起，各种水稻生物技术手段，包括成熟胚的培养，基因的转化以及利用悬浮细胞体系在细胞学水平上揭示其生理功能等也在生物科学中被广泛运用。
1.1 水稻的转基因
在已经过去的大半个世纪里，水稻育种获得了巨大的收获，并且完成了两次比较大的突破。首先是20 世纪6 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
0年代开始的矮秆品种水稻的培育和应用不但提高了收获指数，而且大幅增加了产量潜力；其二是大约10年后开始的杂交稻的培育与推广，使产量在矮秆优良品种的基础上又大幅度增长[1-2]。
在实践中一些常规的育种方法因为周期长，不易获得好的优良品种等，所以基因工程的兴起使作物育种有了新的方向。其中转基因技术对作物育种影响非常深。1996年至2012年，全球的转基因种植面积就从170万公顷增加到1.7亿公顷，在这16年的时间里整整增加了100倍[3]。转基因的研究中Rong 等 [4-5] 的水稻基因飘流率结果为0.04%—0.79%；Chun 等 [6] 研究了抗除草剂水稻的基因飘流率结果为 0.039%[7]。水稻生产过程中，不仅病害会影响水稻的产量和质量，不利的天气和土壤等环境条件也是影响因素之一。所以水稻转基因的应用中如抗虫性转基因，抗病性转基因，抗逆性转基因等都可以改变这些。
首先，虽然转基因技术在未来有很大发展前景，但是技术上还有待改进。其次，在转基因水稻研究上，可利用基因资源的缺乏限制了转基因水稻的新品种的培育。再次，目前转基因技术取得的成果不是很理想，仍然限制着复杂性状的改良。
1.2 水稻愈伤组织培养
植物的组织培养指在人工控制的无菌环境条件下，利用适宜的培养基对离体的植物器官、组织、细胞等进行培养，使它们再生细胞或完整植株的技术[8]。
水稻的基因组很小，通过组织培养技术容易得到再生植株，它获得转基因植株的最好来源是生长和分裂旺盛的胚性愈伤组织。水稻品种改良的重要手段是遗传转化，也是基因克隆不能缺少的步骤，而遗传转化的前提是建立成熟的组织培养和再生体系[9]。近年来，水稻遗传转化的受体有愈伤组织、幼穗、幼胚等，并且各个部位都能诱导出愈伤组织和再生植株，可是幼穗和幼胚容易受季节的限制和在操作中被污染，所以一般都会先由各受体诱导得到愈伤组织，再进行遗传转化，这些都取得了较大的进展。
至今愈伤组织培养被广泛用于水稻育种研究，同时也创造了新的种质资源。水稻的组织培养已在单倍体育种、诱变育种、体细胞杂交及遗传转化等方面得到应用[10]。
1.3 悬浮细胞培养
水稻悬浮细胞有很多优点，比如繁殖速度快、颗粒均一、操作方便等，因此被认为是水稻转基因的理想受体之一[11]。1995年时,在水稻悬浮培养方面，我国的研究者林拥军等人在已有的悬浮细胞体系(杨金水等1979；赵成章等 1981；叶和春1984)基础上建立了许多水稻品种的悬浮细胞系[12]。经过愈伤组织的悬浮振荡培养，游离出单细胞，再用酶法游离原生质体。这一点可以解决转基因工程中资源限制的不足。
但是在悬浮细胞培养之前，首先要进行继代培养，以此培养出具有胚性的，颗粒大小均一，符合悬浮细胞培养要求的愈伤组织细胞。继代过程中，外植体褐化现象很普遍，褐化轻的影响生长发育，重的可以导致植株死亡。而导致褐化的因素有很多，比如操作手法不当、环境的改变、各种激素的影响等。本文研究继代时，不同激素配比对水稻愈伤组织的影响，以找出褐化率相对较少的配方。
2 材料与方法
2.1 供试材料
高表达玉米C4型光合酶基因pepc(PC)水稻和未转该基因的野生型Kitaake（WT）所诱导出来的愈伤组织。
2.2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
培养基
以M8为基本培养基（大量元素、微量元素、铁盐、氯化钙和有机成分），一次继代的主要配方如表1，前6个处理添加2,4-D浓度为1mg/L和1.5mg/L，6-BA浓度设置为0.2mg/L、0.4mg/L和0.5mg/L。处理7、8配方以1.5mg/L2,4-D为主，分别多添加了ABA和KT，pH值调到5.9-6.0。二次继代的主要处理配方如表2，A和B处理继续对第一次继代培养的处理1和2的配方进行培养，C和D配方继续对第一次继代培养其他6个处理配方继代培养的愈伤组织进行第二次继代，pH值调到5.9-6.0[13-15]。
表1 一次继代培养的水稻愈伤组织配方设置
处理 培养基配方（以下每个配方中每升培养基中添加30克蔗糖，8.5克琼脂）
1 2 3 4 5 6 7 8 M8+1mg/L2,4-D+0.2mg/L6-BA M8+1mg/L2,4-D+0.4mg/L6-BA M8+1mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA M8+1.5mg/L2,4-D+0.2mg/L6-BA M8+1.5mg/L2,4-D+0.4mg/L6-BA M8+1.5mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA M8+1.5mg/L2,4-D+1.5mg/L6-BA+1mg/LABA M8+1.5mg/L2,4-D+1mg/L6-BA+0.3mg/LKT
14天 1 75 9.33 70.67 生长比较快，颗粒状较多，黄色
4 85 5.88 70.59 生长快，颗粒多，黄色，分化快
2 80 16.25 58.75 生长慢，颗粒状少，褐化严重，分化少
5 80 13.75 61.25 生长较快，颗粒少，褐化较多
3 80 20.00 80.00 生长慢，干燥，有少数偏白，褐化多
通过控制2,4-D的浓度，观察不同6-BA浓度下水稻愈伤组织的褐化率情况（表5）。
6 80 12.50 87.50 生长略慢，偏干燥，黄色，分化
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