菊花脑同源多倍化过程中tcp家族转录因子的分析
摘要：【目的】在获得了18个TCP基础上筛选出差异较大的一个TCP进行表达分析和功能验证，分析其在多倍体化后的变化模式，进一步探讨菊属植物基因组冲击对基因表达模式的影响。【方法】通过亚细胞定位和转录激活活性，启动子克隆。【结果】18个CnTCP与水稻和拟南芥中的TCP有较高的同源性。二倍体中的CnTCP10和四倍体中的CnTCP9的表达量分别达到43.8和60.8。多倍体化后，有5个CnTCP发生了2倍以上的变化，其中4个（CnTCP15，CnTCP9，CnTCP16和CnTCP18）表现为表达量增加，而CnTCP12的表达量在减少。取表达量较高，多倍体化后表达变化最明显的CnTCP9进行分析发现CnTCP9定位在细胞核中，且CnTCP9不具有转录激活活性。【结论】通过基因克隆，测序，亚细胞定位，转录激活活性和启动子区克隆，我们可以得到菊花脑TCP家族多倍化后其结构，基因表达的影响和其中某一差异较大TCP的表达功能的验证结果。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1 CnTCP基因在不同倍性菊花脑中的表达验证2
1.2.2 CnTCP9亚细胞定位和转录激活活性3
1.2.3 CnTCP9启动子区克隆4
2结果与分析4
2.1 CnTCP基因在转录组中的表现与多倍体化后的表达分析4
2.2 CnTCP9的亚细胞定位与转录激活活性分析5
3讨论6
致谢 7
参考文献7
菊花脑同源多倍化过程中TCP家族转录因子的分析
引言
引言
【研究意义】在自然界中，由同一物种经过基因组自发或者人工加倍形成的多倍体，称为同源多倍体[1]。与二倍体相比，同源多倍体大多表现出细胞体积增大，或者某些器官的巨大化，这种巨大化往往表现在叶片、花瓣、茎秆和株高等有限生长的器官或组织上，但是多倍体化却很少导致整个植株的巨型化，有时甚至相反，这是因为植株的体积不仅取决于细胞的体积，还取决于生长期间所产生的细
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
胞数目[2]。菊花脑（Chrysanthemum nankingense）为菊科（Compositae）菊属多年生宿根草本植物，别名路边黄、菊花叶、黄菊仔等，为栽培菊花近缘种植物[3]。
TCP转录因子家族是植物所特有的转录因子[4]，最早的成员是玉米中的TBl（teosinte branchedl），金鱼草中的CYC（Cycloidea）和水稻中的PCFs。TCP 蛋白可以分为两类：ClassI和ClassII，PCF属于classI，CYC和TB1属于ClassII，它们都形成不典型的螺旋环螺旋结构（noncanonical basicHelixLoopHelix (bHLH) structure），与植物的生长发育有紧密关系。在植物器官的发育过程中，正常的形态发育十分重要，大部分TCP家族基因与植物器官的三维形态发育调控相关，最常见的是调控植物的花器官发育与形态建成[5]。
多倍化所带来的一个直接结果就是基因重复（Genes duplication）。许多基因的表达都显示剂量依赖性，即为加性基因。如果亲本的这些基因表达和表型变异是相加的，那么在多倍体后代中会表现为亲本的中亲值，相当于一加一等于二。如果是非加性基因的表达，那么这些值将大于二或小于二。前者可能因为基因激活，而后者则更多地来源于基因的表达抑制甚至沉默[6]。【前人研究进展】基因激活是指亲本或祖先中原本已经沉默的基因在多倍体形成后又被重新激活表达，是植物基因组多倍体形成过程中经常发生的一个现象[7]。近年来发现被激活的基因大多数都是反转录转座子。研究表明，转座子的激活可能源于染色体断裂、重排以及去甲基化，转座子一旦被激活就会导致基因组表达产生一系列明显的变化。Comai等发现人工合成的拟南芥异源四倍体中存在较小频率基因被重新激活的现象，而这部分被激活的基因是在亲本中沉默或低水平表达的反转录转座子[8]；Madlung等在检测到拟南芥4号染色体异染色质区域时，也发现少数转座子在杂交后形成的拟南芥异源多倍体中被激活[9]。
基因沉默现象普遍存在于植物多倍体形成的早期，且部分沉默基因在多倍体后代中可以稳定遗传。在对小麦新合成的异源六倍体和天然异源六倍体的比较研究中发现，同一基因常常具有相同的沉默模式[10]，而且基因沉默现象最早可发生于基因组加倍前的种间F1代[11]。Comai[12]等在对拟南芥人工合成的异源四倍体的研究中发现，部分F2代个体表现出较大的表型变异和不稳定性，而这些变异和不稳定性很难用孟德尔遗传定律来解释。拟南芥异源四倍体显示出大花环、多叶且叶长、宽、高均较父母本有优势，整体结实率在以后的世代中也逐步提高，表明多倍体的自交不亲性和多倍体化引起的基因表达差异正在逐步改善[13]。Wang等使用芯片对拟南芥异源四倍体和其亲本的基因表达差异进行了详细分析[14]。所选的26,000个基因在A. thaliana和 A. arenosa 中均可以检测到信号[15]，但有超过15％的基因存在差异表达。约2,100个基因（8％）在A. thaliana中检测到了较高的表达，而有1,818个基因（7％）则在 A. arenosa较高[16]。【本研究切入点】先前我们从菊花脑中克隆到了18个TCP转录因子，其中部分TCP在多倍体化后表达量升高，因此，本研究拟对菊花脑同源多倍体化后TCP家族转录因子进行分析，以更好地了解基因组变化对基因表达的影响。【拟解决的关键问题】亚细胞定位和转录细胞激活活性分析，启动子克隆与分析。
1 材料与方法
1．1 材料
本研究所用材料为二倍体菊花脑和四倍体菊花脑。材料保存于大学“中国菊花种质资源保存中心”，常规管理。
1．2 方法
1.2.1 CnTCP基因在不同倍性菊花脑中的表达验证
提取二倍体和四倍体菊花脑的RNA，做三份生物学重复。发现其中CnTCP21，22，23；CnTCP42，43；CnTCP181，182基因因为序列相似性较高，无法使用定量引物分开彼此，所以在引物设计时扩增CnTCP2；CnTCP42/3；CnTCP18总的表达量（表1）。
表1 CnTCP家族基因的定量引物
Table 1 PCR primer sequences used for CnTCP qRTPCR
引物编号
ID
引物序列 (5′3′)
Primer sequence (5′3′)
CnTCP1QF
CAATCGAGCTTTTGGAGTGA
CnTCP1QR
GCAGATCAAGACCAGCCAAT
CnTCP2QF
GGACAAGGGGGTTACCATTT
CnTCP2QR
CAATCTTTCGCGATTTCCTT
CnTCP3QF
GATTGCAGCCCAACAAATTA
CnTCP3QR
GAGAAAAGATCGAACCGGTAA
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1 CnTCP基因在不同倍性菊花脑中的表达验证2
1.2.2 CnTCP9亚细胞定位和转录激活活性3
1.2.3 CnTCP9启动子区克隆4
2结果与分析4
2.1 CnTCP基因在转录组中的表现与多倍体化后的表达分析4
2.2 CnTCP9的亚细胞定位与转录激活活性分析5
3讨论6
致谢 7
参考文献7
菊花脑同源多倍化过程中TCP家族转录因子的分析
引言
引言
【研究意义】在自然界中，由同一物种经过基因组自发或者人工加倍形成的多倍体，称为同源多倍体[1]。与二倍体相比，同源多倍体大多表现出细胞体积增大，或者某些器官的巨大化，这种巨大化往往表现在叶片、花瓣、茎秆和株高等有限生长的器官或组织上，但是多倍体化却很少导致整个植株的巨型化，有时甚至相反，这是因为植株的体积不仅取决于细胞的体积，还取决于生长期间所产生的细
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
胞数目[2]。菊花脑（Chrysanthemum nankingense）为菊科（Compositae）菊属多年生宿根草本植物，别名路边黄、菊花叶、黄菊仔等，为栽培菊花近缘种植物[3]。
TCP转录因子家族是植物所特有的转录因子[4]，最早的成员是玉米中的TBl（teosinte branchedl），金鱼草中的CYC（Cycloidea）和水稻中的PCFs。TCP 蛋白可以分为两类：ClassI和ClassII，PCF属于classI，CYC和TB1属于ClassII，它们都形成不典型的螺旋环螺旋结构（noncanonical basicHelixLoopHelix (bHLH) structure），与植物的生长发育有紧密关系。在植物器官的发育过程中，正常的形态发育十分重要，大部分TCP家族基因与植物器官的三维形态发育调控相关，最常见的是调控植物的花器官发育与形态建成[5]。
多倍化所带来的一个直接结果就是基因重复（Genes duplication）。许多基因的表达都显示剂量依赖性，即为加性基因。如果亲本的这些基因表达和表型变异是相加的，那么在多倍体后代中会表现为亲本的中亲值，相当于一加一等于二。如果是非加性基因的表达，那么这些值将大于二或小于二。前者可能因为基因激活，而后者则更多地来源于基因的表达抑制甚至沉默[6]。【前人研究进展】基因激活是指亲本或祖先中原本已经沉默的基因在多倍体形成后又被重新激活表达，是植物基因组多倍体形成过程中经常发生的一个现象[7]。近年来发现被激活的基因大多数都是反转录转座子。研究表明，转座子的激活可能源于染色体断裂、重排以及去甲基化，转座子一旦被激活就会导致基因组表达产生一系列明显的变化。Comai等发现人工合成的拟南芥异源四倍体中存在较小频率基因被重新激活的现象，而这部分被激活的基因是在亲本中沉默或低水平表达的反转录转座子[8]；Madlung等在检测到拟南芥4号染色体异染色质区域时，也发现少数转座子在杂交后形成的拟南芥异源多倍体中被激活[9]。
基因沉默现象普遍存在于植物多倍体形成的早期，且部分沉默基因在多倍体后代中可以稳定遗传。在对小麦新合成的异源六倍体和天然异源六倍体的比较研究中发现，同一基因常常具有相同的沉默模式[10]，而且基因沉默现象最早可发生于基因组加倍前的种间F1代[11]。Comai[12]等在对拟南芥人工合成的异源四倍体的研究中发现，部分F2代个体表现出较大的表型变异和不稳定性，而这些变异和不稳定性很难用孟德尔遗传定律来解释。拟南芥异源四倍体显示出大花环、多叶且叶长、宽、高均较父母本有优势，整体结实率在以后的世代中也逐步提高，表明多倍体的自交不亲性和多倍体化引起的基因表达差异正在逐步改善[13]。Wang等使用芯片对拟南芥异源四倍体和其亲本的基因表达差异进行了详细分析[14]。所选的26,000个基因在A. thaliana和 A. arenosa 中均可以检测到信号[15]，但有超过15％的基因存在差异表达。约2,100个基因（8％）在A. thaliana中检测到了较高的表达，而有1,818个基因（7％）则在 A. arenosa较高[16]。【本研究切入点】先前我们从菊花脑中克隆到了18个TCP转录因子，其中部分TCP在多倍体化后表达量升高，因此，本研究拟对菊花脑同源多倍体化后TCP家族转录因子进行分析，以更好地了解基因组变化对基因表达的影响。【拟解决的关键问题】亚细胞定位和转录细胞激活活性分析，启动子克隆与分析。
1 材料与方法
1．1 材料
本研究所用材料为二倍体菊花脑和四倍体菊花脑。材料保存于大学“中国菊花种质资源保存中心”，常规管理。
1．2 方法
1.2.1 CnTCP基因在不同倍性菊花脑中的表达验证
提取二倍体和四倍体菊花脑的RNA，做三份生物学重复。发现其中CnTCP21，22，23；CnTCP42，43；CnTCP181，182基因因为序列相似性较高，无法使用定量引物分开彼此，所以在引物设计时扩增CnTCP2；CnTCP42/3；CnTCP18总的表达量（表1）。
表1 CnTCP家族基因的定量引物
Table 1 PCR primer sequences used for CnTCP qRTPCR
引物编号
ID
引物序列 (5′3′)
Primer sequence (5′3′)
CnTCP1QF
CAATCGAGCTTTTGGAGTGA
CnTCP1QR
GCAGATCAAGACCAGCCAAT
CnTCP2QF
GGACAAGGGGGTTACCATTT
CnTCP2QR
CAATCTTTCGCGATTTCCTT
CnTCP3QF
GATTGCAGCCCAACAAATTA
CnTCP3QR
GAGAAAAGATCGAACCGGTAA
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