荷花高亲和力钾离子转运体（hak）基因家族的适应性进化研究
钾离子是植物生长的重要营养元素之一，而高亲和钾离子（HAK）转运体基因家族在钾离子转运体基因家族中的地位举足轻重，在植物生长发育调控以及逆境胁迫的影响中发挥了重要的作用。在模式植物拟南芥和重要经济作物水稻中分布发现了13个和27个HAK转运子基因。本实验搜素了荷花的全基因组，从中发现了18个钾离子高亲和力转运子基因。在系统发生树中，拟南芥、荷花和水稻的HAK转运体基因家族被分成了5个亚族，本实验对荷花HAK转运体基因进行了功能性分歧、正选择作用以及基因转换的鉴定和分析。发现正选择作用和基因转换事件对荷花HAK基因家族的进化有较大作用。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
1 引言 3
2 材料与方法 4
2.1 在基因组水平上鉴定荷花HAK基因 4
2.2 多序列联配并构建系统发生树 4
2.3 正选择的检验 4
3 结果 5
3.1 荷花中的HAK转运体基因 5
3.2 荷花HAK基因的系统发生分析 8
3.3 正选择位点和基因转换的检验 10
4 讨论 12
致谢 13
参考文献 13
荷花高亲和力钾离子转运体（HAK）基因家族的适应性进化研究
引言
引言
钾是植物发育所必需的营养元素之一，也是植物细胞渗透压的重要组分，其在植物体内参与的反应众多，丰富的含量和广泛地分布都是它无可替代的原因[1]。钾离子的含量占植物细胞干重约0.8%～8.0%，在植物细胞内钾离子含量维持在80～200mmol/L[2]。钾参与了蛋白质与糖类的合成过程、渗透调节、氮元素代谢和脂肪代谢、提高植物的抗逆性、促进光合作用、控制细胞膜的极化等生理活动，同时催化植物细胞内多种酶的合成与代谢[1]。在目前的研究中发现，高亲和力钾离子转运体(highaffinity K+，HAK)家族的成员数目，在是植物钾离子转运体的4个家族——KUP/HAK/KT基因家族、HKT/Trk基因家族、KEA基因家族和CHX基因家族中是最多的，可见其地位举足轻重[3]。HAK转运子基因家族成员 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
功能各不相同，它们各自分散于植物体的不同器官和组织中，其中有一部分在特殊的发育时间段和部位表达，绝大部分的HAK转运子基因都经过历位科学研究者的实验和研究检验证明为K+的转运体，受K+饥饿的诱导。植物主要依靠钾离子通道和转运载体完成对K+的吸收、转运与分配等一系列生理活动[4]。根据蛋白对K+的亲和性程度来分类的话，KUP/HAK/KT家族分为高亲和性、低亲和性和双亲和性三类[1]；而根据分子系统发生学分类方法进行分类可将其分为4个基因进化簇[5]。
在1971年，Epstein和Kim[6]合作发现了第一个KUP/HAK/KT家族基因，它是从大肠杆菌(Escherichia coli)中被提取发现的。他们将其命名为KUP(K+ uptake permease)，是因为它在大肠杆菌中担任钾吸收透性酶的编码。之后，科学家们在土壤酵母菌中鉴定得到了KUP的同源基因HAK。这个名称的命名由于该基因可使酵母即是处在在极低的K+浓度条件下仍能在细胞内保持较高的K+含量[7]。GVVYGDLGTSPLY是HAK钾离子转运体存在的保守基序,这一特征在这个基因家族的成员中差别不大[8]。本实验从荷花基因组中筛选出18个荷花的HAK转运体基因，并对荷花HAK转运体基因与拟南芥HAK转运体基因以及水稻HAK转运体基因进行了多序列联配及系统发生树的构建，分析了荷花HAK转运体基因的功能性分歧和正选择作用。
材料与方法
在基因组水平上鉴定荷花HAK基因
从GenBank数据库中获取拟南芥中已知的13个HAK钾离子转运体基因的编码及蛋白质序列。用上一步获得的拟南芥HAK钾离子转运体蛋白序列作检索序列，搜索NCBI数据库，以E≤1010作为筛选标准筛选出满足该条件的蛋白序列作为候选序列。要确认候选序列为荷花HAK基因序列，还需要检验候选序列中是否包含有HAK基因的保守结构域。然后用Pfam软件对候选序列进行保守结构域的比对，含有该保守结构域的候选序列即确认为荷花HAK转运体。接着再把这些已经确定了的荷花HAK转运体蛋白序列作为检索序列重复上面的步骤。最后用这些基因的编码序列用作检索序列，通过Blastn检索KOME数据库，获得基因的全长cDNA序列。最后还需要获取与所得基因匹配的EST序列，用前面测得的荷花HAK基因序列对NCBI的EST数据库分别进行检索。
多序列联配并构建系统发生树
用Clustal软件对检索获得的荷花HAK转运体蛋白序列与拟南芥HAK转运体蛋白序列及水稻HAK转运体蛋白序列进行多序列联配。
系统发生树在分子生物学中，表示着基因序列或蛋白质序列与其祖先序列的关系。将多序列联配的结果录入MEGA中，构建拟南芥、荷花和水稻的HAK基因家族的系统发生树，方法为邻接法，最小进化法和最大简约法。最大简约法是选择出解释数据所需要变化步长最短的系统发生树，这个方法能够在分析的序列位点上没有回复突变或平行突变，且被检验的序列位点数很大的时候推导出很好的进化树。极大似然法最早是应用于对基因频率数据的分析上，该计算方法是选取一个特定的替代模型来分析给定的一组序列数据，在每组序列比对中考虑每个核苷酸替换的概率，概率总和最大的那棵树最有可能是反映真实情况的系统发生树。邻接法是距离矩阵法中的一种，距离矩阵法是先通过各个物种之间的比较，根据一定的假设推导得出分类群之间的进化距离构建进化距离矩阵，利用矩阵计算出最优树的系统进化树计算法[9]。其中的邻接法是最常用的距离法。
系统发生树进行评估方法我们采用的是自举法（bootstrap method），即在排列好的多序列中，有放回的随机地抽取某一列，组成新的排列序列，新的排列序列与原序列的长度保持一致，重复该步骤，得到多组新序列，再用这些新序列进行建树，观察新树与原始树的差别，以此评价进化树的可靠性。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
1 引言 3
2 材料与方法 4
2.1 在基因组水平上鉴定荷花HAK基因 4
2.2 多序列联配并构建系统发生树 4
2.3 正选择的检验 4
3 结果 5
3.1 荷花中的HAK转运体基因 5
3.2 荷花HAK基因的系统发生分析 8
3.3 正选择位点和基因转换的检验 10
4 讨论 12
致谢 13
参考文献 13
荷花高亲和力钾离子转运体（HAK）基因家族的适应性进化研究
引言
引言
钾是植物发育所必需的营养元素之一，也是植物细胞渗透压的重要组分，其在植物体内参与的反应众多，丰富的含量和广泛地分布都是它无可替代的原因[1]。钾离子的含量占植物细胞干重约0.8%～8.0%，在植物细胞内钾离子含量维持在80～200mmol/L[2]。钾参与了蛋白质与糖类的合成过程、渗透调节、氮元素代谢和脂肪代谢、提高植物的抗逆性、促进光合作用、控制细胞膜的极化等生理活动，同时催化植物细胞内多种酶的合成与代谢[1]。在目前的研究中发现，高亲和力钾离子转运体(highaffinity K+，HAK)家族的成员数目，在是植物钾离子转运体的4个家族——KUP/HAK/KT基因家族、HKT/Trk基因家族、KEA基因家族和CHX基因家族中是最多的，可见其地位举足轻重[3]。HAK转运子基因家族成员 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
功能各不相同，它们各自分散于植物体的不同器官和组织中，其中有一部分在特殊的发育时间段和部位表达，绝大部分的HAK转运子基因都经过历位科学研究者的实验和研究检验证明为K+的转运体，受K+饥饿的诱导。植物主要依靠钾离子通道和转运载体完成对K+的吸收、转运与分配等一系列生理活动[4]。根据蛋白对K+的亲和性程度来分类的话，KUP/HAK/KT家族分为高亲和性、低亲和性和双亲和性三类[1]；而根据分子系统发生学分类方法进行分类可将其分为4个基因进化簇[5]。
在1971年，Epstein和Kim[6]合作发现了第一个KUP/HAK/KT家族基因，它是从大肠杆菌(Escherichia coli)中被提取发现的。他们将其命名为KUP(K+ uptake permease)，是因为它在大肠杆菌中担任钾吸收透性酶的编码。之后，科学家们在土壤酵母菌中鉴定得到了KUP的同源基因HAK。这个名称的命名由于该基因可使酵母即是处在在极低的K+浓度条件下仍能在细胞内保持较高的K+含量[7]。GVVYGDLGTSPLY是HAK钾离子转运体存在的保守基序,这一特征在这个基因家族的成员中差别不大[8]。本实验从荷花基因组中筛选出18个荷花的HAK转运体基因，并对荷花HAK转运体基因与拟南芥HAK转运体基因以及水稻HAK转运体基因进行了多序列联配及系统发生树的构建，分析了荷花HAK转运体基因的功能性分歧和正选择作用。
材料与方法
在基因组水平上鉴定荷花HAK基因
从GenBank数据库中获取拟南芥中已知的13个HAK钾离子转运体基因的编码及蛋白质序列。用上一步获得的拟南芥HAK钾离子转运体蛋白序列作检索序列，搜索NCBI数据库，以E≤1010作为筛选标准筛选出满足该条件的蛋白序列作为候选序列。要确认候选序列为荷花HAK基因序列，还需要检验候选序列中是否包含有HAK基因的保守结构域。然后用Pfam软件对候选序列进行保守结构域的比对，含有该保守结构域的候选序列即确认为荷花HAK转运体。接着再把这些已经确定了的荷花HAK转运体蛋白序列作为检索序列重复上面的步骤。最后用这些基因的编码序列用作检索序列，通过Blastn检索KOME数据库，获得基因的全长cDNA序列。最后还需要获取与所得基因匹配的EST序列，用前面测得的荷花HAK基因序列对NCBI的EST数据库分别进行检索。
多序列联配并构建系统发生树
用Clustal软件对检索获得的荷花HAK转运体蛋白序列与拟南芥HAK转运体蛋白序列及水稻HAK转运体蛋白序列进行多序列联配。
系统发生树在分子生物学中，表示着基因序列或蛋白质序列与其祖先序列的关系。将多序列联配的结果录入MEGA中，构建拟南芥、荷花和水稻的HAK基因家族的系统发生树，方法为邻接法，最小进化法和最大简约法。最大简约法是选择出解释数据所需要变化步长最短的系统发生树，这个方法能够在分析的序列位点上没有回复突变或平行突变，且被检验的序列位点数很大的时候推导出很好的进化树。极大似然法最早是应用于对基因频率数据的分析上，该计算方法是选取一个特定的替代模型来分析给定的一组序列数据，在每组序列比对中考虑每个核苷酸替换的概率，概率总和最大的那棵树最有可能是反映真实情况的系统发生树。邻接法是距离矩阵法中的一种，距离矩阵法是先通过各个物种之间的比较，根据一定的假设推导得出分类群之间的进化距离构建进化距离矩阵，利用矩阵计算出最优树的系统进化树计算法[9]。其中的邻接法是最常用的距离法。
系统发生树进行评估方法我们采用的是自举法（bootstrap method），即在排列好的多序列中，有放回的随机地抽取某一列，组成新的排列序列，新的排列序列与原序列的长度保持一致，重复该步骤，得到多组新序列，再用这些新序列进行建树，观察新树与原始树的差别，以此评价进化树的可靠性。
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