不结球白菜叶肉原生质体的分离条件的优化
摘要：不结球白菜叶肉原生质体的分离是研究影响不结球白菜叶肉原生质体分离和纯化的主要因素，为原生质体的离体培养、融合以及外源遗传物质转化等生物技术奠定基础，对不结球白菜的遗传育种和种质资源开发、利用等具有重要意义。本研究以不结球白菜‘矮脚黄’品种叶片作为研究材料，利用酶解法对不结球白菜的叶肉进行原生质体分离试验，对试验中：酶解时间、pH值及离心速度等酶解条件进行调整、优化，采用血球计数板和0.01%荧光素双醋酸酯（FDA）染色法对所提取原生质体的数量与活力进行测定。结果表明，在1.5h的酶解时间，pH=5.7且离心速度为800rpm时，可分离获得数量多，活力高的叶肉原生质体。从而，分析总结出适合于不结球白菜‘矮脚黄’品种叶肉原生质体分离的方案。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1试验材料 2
1.2试验方法 2
1.2.1酶液配制2
1.2.2原生质体的分离与纯化2
1.2.3原生质体的数量测定3
1.2.4原生质体的活力测定3
1.3 试验条件优化3
1.3.1 酶解时间的选择3
1.3.2酶液pH值的选择3
1.3.3离心速度的选择3
2结果与分析3
2.1不结球白菜叶肉原生质体的观察与测定3
2.2酶解时间对不结球白菜叶肉原生质体分离的影响4
2.3酶液pH值对不结球白菜叶肉原生质体分离的影响4
2.4离心速度对不结球白菜叶肉原生质体分离的影响5
3 讨论 5
致谢6
参考文献6
图1不结球白菜叶肉原生质体的活力检测4
表1酶解时间对不结球白菜叶肉原生质体分离的影响4
表2 MES的PH值对不结球白菜叶肉原生质体分离的影响5
不结球白菜叶肉原生质体的分离条件的优化
引言
不结球白菜（Brassica campestris ssp.chinensis Makino）又称青菜、小白
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
菜，十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica）芸薹种（B.campestris, syn.B.rapa）。原产于中国，具有生产成本低廉、适应性广、栽培迅速以及营养丰富等特点，现被北方甚至东南亚和欧美地区都广泛引种栽培。原生质体（protoplast）是指除去细胞壁后，获得的仍保持活力的只由质膜包裹的微球体。原生质体在植物育种、基因工程、遗传特性研究等方面都具有深刻意义[1]。细胞壁被酶解后的原生质体具有以下特点：(1)具有生成完整植株的全能性；(2)具有与其亲本相似的遗传物质；(3)融合性，可融合形成杂种细胞，克服不亲和障碍（科间、属间、种间和品种间）；(4)无细胞障碍，能摄取病毒、细菌、质粒、DNA等多种外源物质[23,45]。作为重要的生物材料，在原生质体离体培养和植株再生、原生质体融合及外源遗传物质转化等植物原生质体技术中被广泛应用[6]。不结球白菜的原生质体可用于其品种改良和创造远缘杂交品种，新品种的培育和种质资源开发、利用等[78]，因此，分离提取出数量多，活力强的叶肉原生质体为相关原生质体研究累积了丰富的基础资源。
植物原生质体一词，最早是由Hanstein在1880年提出的，而植物原生质体分离则是到了1892年，Klercker采用机械法制得，但所获得的原生质体活性和数量均很低[2]。直到20世纪60年代，英国的植物生理学家Cocking率先使用酶解法从而开创了分离原生质体的先例[9]。此后，生物学家研究各类植物材料，植株的各个器官，采用这些材料分离制备原生质体，使得原生质体的分离技术在短时间内发展迅速。自Kartha于1974年利用油菜叶肉成功分离其原生质体并培养获得再生植株[10]后，很长一段时间后才陆续有甘蓝[11]、芥菜[12]、白菜[13] 等十字花科芸薹属植物获得分离原生质体的突破，近年来也获得了甘蓝和白菜体细胞杂交植株[14],但作为重要蔬菜的不结球白菜尚未能获得再生植株。原生质体技术运用的前提是获得活性高、数量大的原生质体，迄今尚无对不结球白菜叶肉原生质体的分离的系统研究[1516]。因此，本文选择不结球白菜‘矮脚黄’品种，做关于其叶肉原生质体的分离试验，分析酶解时间、酶液pH值及离心速度等影响因素对原生质体分离的作用，为接下来关于其原生质体的培养再生、融合以及外源遗传物质转化等一系列技术的应用打下基础，为不结球白菜的遗传育种研究和种质资源开发、利用等提供新的技术手段。
1 材料与方法
1．1 试验材料
试验材料为不结球白菜‘矮脚黄’品种植株，种子来源于大学园艺学院不结球白菜课题组。
选取饱满不结球白菜‘矮脚黄’品种的种子，在营养土和蛭石质量比为1：3的培养基质中播种栽培。置于人工条件气候室，设定培养条件为：温度 25 ℃，相对湿度70%，光强300 μmol(m 2(s1，12 h光/暗培养。取生长4周左右幼苗健全、饱满且完全伸展的第一片真叶（即顶端第二叶）作为原生质体分离的试验材料。
1．2 试验方法
1．2．1 酶液配制 酶液组成:主要为1.5g/100mL纤维素酶（cellulase R10），0.3g/100mL离析酶（mecerozyme R10）两种酶，除此之外，附加0.4 mol/L 甘露醇（mannitol），20 mmol/L的 KCl，20 mmol/L 的MES，并加入66.7%（V/V）的蒸馏水，55℃水浴加热10 min后，冷却至室温再加入10 mmol/L的CaCl2，0.1% BSA，5 mmol/L的β巯基乙醇（βMercaptoethanol）。以上溶液混合均匀后，用0.45μm的微孔滤膜过滤除菌，待用。
1．2．2 原生质体的分离与纯化 选择不结球白菜生长四周左右的幼苗，取其饱满、健全的第一片真叶（完全展开叶）1g。清水洗涤35次， 再用70%（V/V）酒精消毒30s，10%（V/V）次氯酸钠消毒10min，最后蒸馏水流水冲洗叶片23次，用吸水纸吸拭干叶片上的水珠。用刀片将其切成1mm左右宽度的薄片长条，随后按照材料：酶液=1：10 的比例用镊子立即将切好的材料置于事先配置好的不同pH值的酶液中（表1）。封口后，放置于25℃，黑暗条件静置处理12 h，使细胞壁在酶的作用下裂解。酶解后，利用200目的尼龙细胞筛将绿色混合酶解液过滤，从而过滤掉多余的材料和未酶解彻底的组织、杂质，分装至15mL离心管，再将滤液置于离心机（Centrifuge 5810R）中800 rpm离心5 min，弃上清，在沉淀中加入 W5 buffer悬浮再离心，原生质体通过温柔的涡旋重旋于W5 buffer中，W5重复洗3次。将离心管放于冰上进行沉淀，30min后，小心移除上清。
W5 buffer溶液：154 mmol/L NaCl，25 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl，2 mmol/L MES(pH值=5.7)，利用KOH调节W5溶液pH值至5.7，高温高压灭菌20min。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1试验材料 2
1.2试验方法 2
1.2.1酶液配制2
1.2.2原生质体的分离与纯化2
1.2.3原生质体的数量测定3
1.2.4原生质体的活力测定3
1.3 试验条件优化3
1.3.1 酶解时间的选择3
1.3.2酶液pH值的选择3
1.3.3离心速度的选择3
2结果与分析3
2.1不结球白菜叶肉原生质体的观察与测定3
2.2酶解时间对不结球白菜叶肉原生质体分离的影响4
2.3酶液pH值对不结球白菜叶肉原生质体分离的影响4
2.4离心速度对不结球白菜叶肉原生质体分离的影响5
3 讨论 5
致谢6
参考文献6
图1不结球白菜叶肉原生质体的活力检测4
表1酶解时间对不结球白菜叶肉原生质体分离的影响4
表2 MES的PH值对不结球白菜叶肉原生质体分离的影响5
不结球白菜叶肉原生质体的分离条件的优化
引言
不结球白菜（Brassica campestris ssp.chinensis Makino）又称青菜、小白
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
菜，十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica）芸薹种（B.campestris, syn.B.rapa）。原产于中国，具有生产成本低廉、适应性广、栽培迅速以及营养丰富等特点，现被北方甚至东南亚和欧美地区都广泛引种栽培。原生质体（protoplast）是指除去细胞壁后，获得的仍保持活力的只由质膜包裹的微球体。原生质体在植物育种、基因工程、遗传特性研究等方面都具有深刻意义[1]。细胞壁被酶解后的原生质体具有以下特点：(1)具有生成完整植株的全能性；(2)具有与其亲本相似的遗传物质；(3)融合性，可融合形成杂种细胞，克服不亲和障碍（科间、属间、种间和品种间）；(4)无细胞障碍，能摄取病毒、细菌、质粒、DNA等多种外源物质[23,45]。作为重要的生物材料，在原生质体离体培养和植株再生、原生质体融合及外源遗传物质转化等植物原生质体技术中被广泛应用[6]。不结球白菜的原生质体可用于其品种改良和创造远缘杂交品种，新品种的培育和种质资源开发、利用等[78]，因此，分离提取出数量多，活力强的叶肉原生质体为相关原生质体研究累积了丰富的基础资源。
植物原生质体一词，最早是由Hanstein在1880年提出的，而植物原生质体分离则是到了1892年，Klercker采用机械法制得，但所获得的原生质体活性和数量均很低[2]。直到20世纪60年代，英国的植物生理学家Cocking率先使用酶解法从而开创了分离原生质体的先例[9]。此后，生物学家研究各类植物材料，植株的各个器官，采用这些材料分离制备原生质体，使得原生质体的分离技术在短时间内发展迅速。自Kartha于1974年利用油菜叶肉成功分离其原生质体并培养获得再生植株[10]后，很长一段时间后才陆续有甘蓝[11]、芥菜[12]、白菜[13] 等十字花科芸薹属植物获得分离原生质体的突破，近年来也获得了甘蓝和白菜体细胞杂交植株[14],但作为重要蔬菜的不结球白菜尚未能获得再生植株。原生质体技术运用的前提是获得活性高、数量大的原生质体，迄今尚无对不结球白菜叶肉原生质体的分离的系统研究[1516]。因此，本文选择不结球白菜‘矮脚黄’品种，做关于其叶肉原生质体的分离试验，分析酶解时间、酶液pH值及离心速度等影响因素对原生质体分离的作用，为接下来关于其原生质体的培养再生、融合以及外源遗传物质转化等一系列技术的应用打下基础，为不结球白菜的遗传育种研究和种质资源开发、利用等提供新的技术手段。
1 材料与方法
1．1 试验材料
试验材料为不结球白菜‘矮脚黄’品种植株，种子来源于大学园艺学院不结球白菜课题组。
选取饱满不结球白菜‘矮脚黄’品种的种子，在营养土和蛭石质量比为1：3的培养基质中播种栽培。置于人工条件气候室，设定培养条件为：温度 25 ℃，相对湿度70%，光强300 μmol(m 2(s1，12 h光/暗培养。取生长4周左右幼苗健全、饱满且完全伸展的第一片真叶（即顶端第二叶）作为原生质体分离的试验材料。
1．2 试验方法
1．2．1 酶液配制 酶液组成:主要为1.5g/100mL纤维素酶（cellulase R10），0.3g/100mL离析酶（mecerozyme R10）两种酶，除此之外，附加0.4 mol/L 甘露醇（mannitol），20 mmol/L的 KCl，20 mmol/L 的MES，并加入66.7%（V/V）的蒸馏水，55℃水浴加热10 min后，冷却至室温再加入10 mmol/L的CaCl2，0.1% BSA，5 mmol/L的β巯基乙醇（βMercaptoethanol）。以上溶液混合均匀后，用0.45μm的微孔滤膜过滤除菌，待用。
1．2．2 原生质体的分离与纯化 选择不结球白菜生长四周左右的幼苗，取其饱满、健全的第一片真叶（完全展开叶）1g。清水洗涤35次， 再用70%（V/V）酒精消毒30s，10%（V/V）次氯酸钠消毒10min，最后蒸馏水流水冲洗叶片23次，用吸水纸吸拭干叶片上的水珠。用刀片将其切成1mm左右宽度的薄片长条，随后按照材料：酶液=1：10 的比例用镊子立即将切好的材料置于事先配置好的不同pH值的酶液中（表1）。封口后，放置于25℃，黑暗条件静置处理12 h，使细胞壁在酶的作用下裂解。酶解后，利用200目的尼龙细胞筛将绿色混合酶解液过滤，从而过滤掉多余的材料和未酶解彻底的组织、杂质，分装至15mL离心管，再将滤液置于离心机（Centrifuge 5810R）中800 rpm离心5 min，弃上清，在沉淀中加入 W5 buffer悬浮再离心，原生质体通过温柔的涡旋重旋于W5 buffer中，W5重复洗3次。将离心管放于冰上进行沉淀，30min后，小心移除上清。
W5 buffer溶液：154 mmol/L NaCl，25 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl，2 mmol/L MES(pH值=5.7)，利用KOH调节W5溶液pH值至5.7，高温高压灭菌20min。
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