外源ala对翠冠梨花粉萌发和花粉管生长的影响
本文以‘翠冠’梨为材料，研究外源ALA处理对花粉萌发及花粉管生长的影响。结果表明，ALA抑制花粉萌发及花粉管生长。ALA浓度为50 mg?L-1时，花粉萌发率比对照下降 96.1%，花粉管长度仅为对照的12.0%； CAT、SOD活性随着ALA浓度增加表现出先上升后下降的趋势。培养基中加入适宜浓度的Ca2+可显著缓解ALA的抑制作用。加入EGTA缓解作用消失。花柱荧光显微镜观察表明，ALA抑制了梨花花粉在柱头上萌发和花粉管生长，花粉管生长受抑制程度与ALA处理的时间有关。ALA处理越早，其受抑制程度越高。人工授粉前24h用外源ALA处理，花粉萌发数量显著下降,且花粉管长度约为对照的1/2 。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1. 2 花粉液体培养2
1.2.1培养方法2
1.2.2实验处理2
1.2.3花粉萌发率和花粉管长度测定2
1.2.4梨花粉抗氧化酶活性的测定3
1.3 ALA处理后梨花花柱上花粉管生长情况观察3
1. 4数据处理3
2 结果与分析3
2. 1不同浓度ALA对离体梨花花粉萌发和花粉管生长的影响3
2．1．1 ALA处理花粉萌发率和花粉管生长长度的影响 3
2．1．2 ALA处理对抗氧化酶活性的影响 4
2．2 不同浓度Ca2+对ALA抑制作用的缓解 5
2．3 不同时期ALA处理对‘翠冠’梨花花柱中花粉管生长情况 6
3 讨论 7
致谢9
参考文献9
外源ALA对翠冠梨花粉萌发和花粉管生长的影响
引言
引言
梨属于蔷薇科(Rosaceae)苹果亚科(Maloideae)梨属(Pyrus)植物, 梨可鲜食或加工制成梨酒、梨膏、梨汁等，营养价值高，还具有一定的医疗价值，是世界主要果树之一,在果树生产上占有极其重要的地位[[]]。
梨树花芽容易形成，自然坐果率高，常因坐果过 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
多，造成树体消耗养分过大，叶片早落，果实商品性降低，花芽分化不良等不良后果。因此，疏除多余的花果，调节生长和结果的矛盾，是防止大小年，达到优质稳产的有效措施。
利用化学方法进行疏花疏果是克服果树大小年与提高果品质量的一项重要手段。但不同的化学药剂处理其机理不同，效果也不同[]。在梨树花期喷布萘乙酸（NAA）和萘乙酸酰胺，会使花粉管伸长受阻，不能正常受精，造成落果；在幼果期喷布萘乙酸（NAA）和萘乙酸酰胺，则会干扰内源激素的代谢和运输，促进乙烯形成而导致落果；在梨树幼果期喷布乙烯利是通过提高乙烯水平，促使离层细胞解体而导致落果，但有效期较短。PP333既能加速胚囊早熟并退化,也能阻止花粉粒的萌发和花粉管的生长[]。
5–氨基乙酰丙酸（ALA）作为一种新型植物生长促进剂[]或者抗逆增强剂 [, ]已经有大量的研究报道。高浓度时，它还可以作为一种可自然光解的农田除草剂[]。正是基于除草剂原理，申明等[]提出，600~1200 mgL1ALA可以疏除梨树过多的花朵，减少人工疏果工作量，不仅提高了果实外观品质，而且改善了内在风味。然而，较低浓度的ALA 对花粉萌发的影响迄今未见报道。
本试验以‘翠冠’梨为材料，研究不同浓度的ALA对花粉萌发及花粉管生长的影响，以期阐明ALA对花粉的萌发和花粉管生长影响的机制，并为在果树生产上进一步利用ALA等提供理论依据
1 材料与方法
1．1 材料
实验材料采自大学江浦园艺站梨园，梨树品种为‘翠冠’。 梨花花粉采集开花前1~2d铃铛花蕾用硫酸纸包好，放在通风阴凉处风干，待花粉散出后置于变色硅胶中贮于–20 ℃冰箱中备用。采集少量‘明水’梨花粉，处理方法同上。梨花花枝采自大学江浦园艺站梨园，剪‘翠冠’梨结果枝，水培于光照培养箱内。到大蕾期，人工去瓣去雄。
1．2花粉液体培养
1．2．1培养方法
花粉液体培养基为10%蔗糖+0.01%硼酸，取10ml培养液于培养皿中，将花粉均匀洒在上面，在黑暗、25℃条件下恒温培养2h。
1．2．2 实验处理
实验处理设有ALA、ALA+Ca2+、ALA+Ca2++EGTA，其中ALA浓度为5、10、20、50mg?L1; Ca2+浓度为：5×103molL1、1×103 molL1、5×104 molL1、1×104 molL1; EGTA浓度为：103 molL1
1．2．3 花粉萌发率和花粉管长度测定
在显微镜下观测花粉萌发率及花粉管生长长度。每个处理重复3次，每个重复选取10个视野。以花粉管长度大于花粉粒直径视为萌发，花粉萌发率% = (花粉萌发数/花粉总数)× 100。每个视野测定10 个花粉管长度并计算平均值。
1．2．4 梨花粉抗氧化酶活性的测定
粗酶液制备：花粉液体培养基为10%蔗糖+0.01%硼酸，实验处理为0、5、10、20、50 mg?L1ALA, 每个处理重复3次。每份称取0.02g花粉在黑暗、25℃条件下恒温培养培养3h后，冰水浴抑制花粉管继续生长。于4℃，10000r/min 离心 10min，弃上清液，将沉淀花粉倒入研钵中，加入少许石英砂，3ml 预冷的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，于4℃，10000r/min 条件下离心15min，取上清液，即为粗酶液。
过氧化氢酶(CAT) 测定采用杨兰芳等[]的方法, 利用紫外分光光度法在 240nm 下直接测定溶液过氧化氢的浓度来测定植物过氧化氢酶活性。
超氧化物歧化酶（SOD）测定采用NBT光化还原法[]，以抑制氮蓝四唑（NBT）光化还原的50%为1个SOD酶活性单位（U）。
1．3 ALA处理后梨花花柱上花粉管生长情况观察
采用荧光显微镜法进行观察，参照Hiratsuka等[]的方法并作了部分修改。具体流程方法如下：剪取‘翠冠’梨结果枝，水培于光照培养箱内。到大蕾期，人工去瓣去雄，用‘明水’花粉进行人工授粉，并在授粉前24h、12h、6h、4h分别喷施10mg?L1ALA溶液，以清水为对照，48h后采集不同处理的花柱用FAA（5ml 福尔马林、5ml冰醋酸、90ml体积分数70%乙醇）固定。待样品全部取完后，将固定的花柱从基部切下复水。将花柱置于2mol/L的NaOH溶液中，65℃水浴2h。蒸馏水冲洗3次，放入水溶性苯胺蓝溶液（1g/L的苯胺蓝+0.1mol/L磷酸钾）染色约4h。花柱压片参照Knox[]的方法在载玻片上滴一滴甘油，加盖玻片，均匀用力，花柱整体压片，用宏观变倍体式荧光显微镜进行荧光观察并拍照。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1. 2 花粉液体培养2
1.2.1培养方法2
1.2.2实验处理2
1.2.3花粉萌发率和花粉管长度测定2
1.2.4梨花粉抗氧化酶活性的测定3
1.3 ALA处理后梨花花柱上花粉管生长情况观察3
1. 4数据处理3
2 结果与分析3
2. 1不同浓度ALA对离体梨花花粉萌发和花粉管生长的影响3
2．1．1 ALA处理花粉萌发率和花粉管生长长度的影响 3
2．1．2 ALA处理对抗氧化酶活性的影响 4
2．2 不同浓度Ca2+对ALA抑制作用的缓解 5
2．3 不同时期ALA处理对‘翠冠’梨花花柱中花粉管生长情况 6
3 讨论 7
致谢9
参考文献9
外源ALA对翠冠梨花粉萌发和花粉管生长的影响
引言
引言
梨属于蔷薇科(Rosaceae)苹果亚科(Maloideae)梨属(Pyrus)植物, 梨可鲜食或加工制成梨酒、梨膏、梨汁等，营养价值高，还具有一定的医疗价值，是世界主要果树之一,在果树生产上占有极其重要的地位[[]]。
梨树花芽容易形成，自然坐果率高，常因坐果过 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
多，造成树体消耗养分过大，叶片早落，果实商品性降低，花芽分化不良等不良后果。因此，疏除多余的花果，调节生长和结果的矛盾，是防止大小年，达到优质稳产的有效措施。
利用化学方法进行疏花疏果是克服果树大小年与提高果品质量的一项重要手段。但不同的化学药剂处理其机理不同，效果也不同[]。在梨树花期喷布萘乙酸（NAA）和萘乙酸酰胺，会使花粉管伸长受阻，不能正常受精，造成落果；在幼果期喷布萘乙酸（NAA）和萘乙酸酰胺，则会干扰内源激素的代谢和运输，促进乙烯形成而导致落果；在梨树幼果期喷布乙烯利是通过提高乙烯水平，促使离层细胞解体而导致落果，但有效期较短。PP333既能加速胚囊早熟并退化,也能阻止花粉粒的萌发和花粉管的生长[]。
5–氨基乙酰丙酸（ALA）作为一种新型植物生长促进剂[]或者抗逆增强剂 [, ]已经有大量的研究报道。高浓度时，它还可以作为一种可自然光解的农田除草剂[]。正是基于除草剂原理，申明等[]提出，600~1200 mgL1ALA可以疏除梨树过多的花朵，减少人工疏果工作量，不仅提高了果实外观品质，而且改善了内在风味。然而，较低浓度的ALA 对花粉萌发的影响迄今未见报道。
本试验以‘翠冠’梨为材料，研究不同浓度的ALA对花粉萌发及花粉管生长的影响，以期阐明ALA对花粉的萌发和花粉管生长影响的机制，并为在果树生产上进一步利用ALA等提供理论依据
1 材料与方法
1．1 材料
实验材料采自大学江浦园艺站梨园，梨树品种为‘翠冠’。 梨花花粉采集开花前1~2d铃铛花蕾用硫酸纸包好，放在通风阴凉处风干，待花粉散出后置于变色硅胶中贮于–20 ℃冰箱中备用。采集少量‘明水’梨花粉，处理方法同上。梨花花枝采自大学江浦园艺站梨园，剪‘翠冠’梨结果枝，水培于光照培养箱内。到大蕾期，人工去瓣去雄。
1．2花粉液体培养
1．2．1培养方法
花粉液体培养基为10%蔗糖+0.01%硼酸，取10ml培养液于培养皿中，将花粉均匀洒在上面，在黑暗、25℃条件下恒温培养2h。
1．2．2 实验处理
实验处理设有ALA、ALA+Ca2+、ALA+Ca2++EGTA，其中ALA浓度为5、10、20、50mg?L1; Ca2+浓度为：5×103molL1、1×103 molL1、5×104 molL1、1×104 molL1; EGTA浓度为：103 molL1
1．2．3 花粉萌发率和花粉管长度测定
在显微镜下观测花粉萌发率及花粉管生长长度。每个处理重复3次，每个重复选取10个视野。以花粉管长度大于花粉粒直径视为萌发，花粉萌发率% = (花粉萌发数/花粉总数)× 100。每个视野测定10 个花粉管长度并计算平均值。
1．2．4 梨花粉抗氧化酶活性的测定
粗酶液制备：花粉液体培养基为10%蔗糖+0.01%硼酸，实验处理为0、5、10、20、50 mg?L1ALA, 每个处理重复3次。每份称取0.02g花粉在黑暗、25℃条件下恒温培养培养3h后，冰水浴抑制花粉管继续生长。于4℃，10000r/min 离心 10min，弃上清液，将沉淀花粉倒入研钵中，加入少许石英砂，3ml 预冷的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，于4℃，10000r/min 条件下离心15min，取上清液，即为粗酶液。
过氧化氢酶(CAT) 测定采用杨兰芳等[]的方法, 利用紫外分光光度法在 240nm 下直接测定溶液过氧化氢的浓度来测定植物过氧化氢酶活性。
超氧化物歧化酶（SOD）测定采用NBT光化还原法[]，以抑制氮蓝四唑（NBT）光化还原的50%为1个SOD酶活性单位（U）。
1．3 ALA处理后梨花花柱上花粉管生长情况观察
采用荧光显微镜法进行观察，参照Hiratsuka等[]的方法并作了部分修改。具体流程方法如下：剪取‘翠冠’梨结果枝，水培于光照培养箱内。到大蕾期，人工去瓣去雄，用‘明水’花粉进行人工授粉，并在授粉前24h、12h、6h、4h分别喷施10mg?L1ALA溶液，以清水为对照，48h后采集不同处理的花柱用FAA（5ml 福尔马林、5ml冰醋酸、90ml体积分数70%乙醇）固定。待样品全部取完后，将固定的花柱从基部切下复水。将花柱置于2mol/L的NaOH溶液中，65℃水浴2h。蒸馏水冲洗3次，放入水溶性苯胺蓝溶液（1g/L的苯胺蓝+0.1mol/L磷酸钾）染色约4h。花柱压片参照Knox[]的方法在载玻片上滴一滴甘油，加盖玻片，均匀用力，花柱整体压片，用宏观变倍体式荧光显微镜进行荧光观察并拍照。
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