草莓della蛋白的分析与克隆鉴定
草莓(Fragaria × ananassa?Duch.)是蔷薇科多年生草本植物，其果实具有很高的营养价值。在生产过程中，可以通过施加赤霉素来调控草莓的生长，从而提高草莓的产量和品质。DELLA蛋白是赤霉素信号传导过程中的重要调控因子。本研究以数据库分析得到的DELLA蛋白的保守结构域作为检索序列，鉴定森林草莓的DELLA蛋白编码基因。研究发现森林草莓基因组中有2个DELLA蛋白编码基因，进化分析发现草莓DELLA蛋白与拟南芥、番茄等植物中的同源蛋白具有较高的同源性，表达分析发现这两个DELLA蛋白编码基因在所有检测组织的表达趋势相似。最后，我们提取草莓总RNA，反转录生成cDNA，设计基因特异性引物，扩增到了草莓的两个DELLA蛋白编码基因并成功地构建了草莓DELLA蛋白基因过量表达载体，为DELLA蛋白的进一步功能研究打下了坚实的基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2方法 3
1.2.1基因序列分析3
1.2.2基因表达分析3
1.2.3总RNA的提取和cDNA的合成3
1.2.4目的基因的克隆4
1.2.5构建基因表达载体4
2结果与分析4
2.1森林草莓DELLA 蛋白生物信息学分析5
2.1.1基因序列全长与同源性比较5
2.1.2基因芯片数据与基因表达热图 6
2.2森林草莓不同组织器官的Total RNA提取7
2.3草莓DELLA 蛋白编码基因克隆与过量表达载体构建 7
3讨论 8
致谢 9
参考文献10
图1草莓DELLA蛋白与拟南芥DELLA蛋白的序列比对6
图2不同植物来源DELLA蛋白的系统进化关系6
图3基因表达热图 7
图4 Plant Total RNA Isolation Kit Plus法提取的RNA电泳图7
图5草莓DELLA基因克隆与过量表达载体构建8
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
表1引物序列4
草莓DELLA蛋白的分析与克隆鉴定
引言
植物从种子萌发到果实成熟的整个生命循环过程受到许多内源因子的调节。赤霉素(GA)作为一种重要的生长激素，能够调控植物胚根的生长、茎杆的伸长、叶片的延展、花的发育、植物次生代谢产物的合成、花器的分化和果实的成熟等各个方面[1]。在以上几个方向中，GA的最显著的调控方向是对植物株型的调控，外施GA或者植物体内GA浓度升高时可以使植物的茎干伸长，而当植物感受不到GA信号时，则产生矮化的表型。如在草莓的营养生长阶段，外施GA可以促进草莓匍匐茎的生长，而在着果阶段，施加GA可以促进花梗和叶柄的伸长，从而防止因植株生长过于紧簇而引起的病害。用GA处理后的草莓植株，其匍匐茎的数量显著提高，同时也使叶片数增加,而且使单个叶片的大小也明显增大。另外，GA对保护地草莓有打破休眠、促进植株发育、提早物候期和采收提前的作用，而且植株生长整齐，无矮化现象。
作为重要的植物生长调节剂，GA的作用机理在拟南芥、水稻等模式植物中已经研究的比较清楚，目前许多GA 合成与信号传导通路中的关键因子均已被分离鉴定。其中包括GA 合成途径的关键酶GA13oxidase ，GA20 oxidase ，GA3 oxidase 和GA2 oxidase ，GA 受体GID1(GIBBERELLININSENSITIVEDWARF1)，DELLA 蛋白以及Fbox 蛋白SLY1/GID2 等。
作为GA信号传导途径中的重要调控因子，DELLA蛋白在GA信号通路中起到承上启下的关键作用。是GA信号传导过程中的关键负调控因子，在GA信号传导过程中发挥阻遏作用，几乎抑制所有依赖GA的植物生长过程。它的积累会阻遏植物生长，其突变体的典型特征为植株矮化、迟花以及叶片深绿色[2]。
目前，已经在多种植物中鉴定并克隆到了DELLA 蛋白，拟南芥基因组中共有5个编码 DELLA 蛋白的基因，它们分别是：RGA(REPRESSOR of GA13)、GAI ( GIBBERELLIN INSENSITIVE ) 、RGL1 ( RGA Like1 ) 、RGL2 和 RGL3 [3]。它们均定位在细胞核，功能上冗余，但仍存在部分差异，RGA 与GAI 抑制植物的营养生长和诱导成花，RGL2 抑制种子萌发，RGA、RGL1、RGL2 三者共同调控花序发育而RGL3 则与植物对环境胁迫的适应有关[4]。研究还发现DELLA蛋白除了调控植物株型外还能够调控花青苷的合成，拟南芥中DELLA蛋白能够促进花青苷的合成。
DELLA蛋白属于植物特异的GRAS家族成员，不同植物中发现的DELLA蛋白在结构上均高度保守，在其蛋白序列的N端具有保守的DELLA结构域（包括DELLA 和VHYNP 两个酸性基序），其C端则为具有转录调节功能的GRAS结构域，在这一结构域中同样含有一些保守的基序，如LHRI，LHRII，VHIID, PFYRE 和SAW [5]。当GA受体GID1与有生物活性的GA结合后导致GID1改变构象，通过N端与DELLA蛋白的DELLA结构域结合，形成GAGID1DELLA复合体，DELLA结构域对复合体的形成是必需的，缺失掉结构域的DELLA蛋白不能与GID1相互作用，即使存在有活性的GA也不能形成复合体[6,7]。随后，GAGID1复合体促进DELLA蛋白同SCFGID2/SLY1E3连接酶蛋白复合体特异地发生亲和反应，并最终通过26S蛋白酶体降解DELLA蛋白，从而解除DELLA蛋白的阻遏作用，完成赤霉素信号反应[8]。
作为GA信号传导途径中的关键负调控因子，一直以来，DELLA蛋白都是植物激素信号通路的研究热点之一。由于定位于细胞核而且能够调控其它基因的表达，以前一直认为DELLA蛋白是一类转录因子，但在DELLA蛋白的序列中并不含有DNA结合域，染色质免疫共沉淀(ChIP)实验也表明DELLA富集DNA的能力并不强。因此，人们推测DELLA可能与其它转录因子结合而调控下游基因的表达，2008年Feng和Lucas等人发现，DELLA蛋白RGA通过与光敏色素作用因子(phytochromeinteractingfactors，PIFs)PIF3/PIF4的互作调控拟南芥下胚轴的生长[9,10]。2013年Bai等人进一步研究发现，在调控拟南芥下胚轴伸长反应中还需要油菜素内酯(Brassinolide，BR)信号通路中的关键基因BZR1的参与，表明植物能够将BR，光信号与GA信号通路整合在一起调控植物的生长[11]。同样的调控方式还在GA调控茉莉酸(jasmonic acid，JA)信号反应和促进植物开花过程中被发现；拟南芥DELLA 蛋白结合JA信号途径中的转录抑制因子JAZ1从而释放MYC2，激活依赖于MYC2的下游JA响应基因的表达，而当GA存在时，DELLAs 被降解，JAZs 与MYC2 结合，抑制MYC2 下游JA 响应基因的表达[12]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2方法 3
1.2.1基因序列分析3
1.2.2基因表达分析3
1.2.3总RNA的提取和cDNA的合成3
1.2.4目的基因的克隆4
1.2.5构建基因表达载体4
2结果与分析4
2.1森林草莓DELLA 蛋白生物信息学分析5
2.1.1基因序列全长与同源性比较5
2.1.2基因芯片数据与基因表达热图 6
2.2森林草莓不同组织器官的Total RNA提取7
2.3草莓DELLA 蛋白编码基因克隆与过量表达载体构建 7
3讨论 8
致谢 9
参考文献10
图1草莓DELLA蛋白与拟南芥DELLA蛋白的序列比对6
图2不同植物来源DELLA蛋白的系统进化关系6
图3基因表达热图 7
图4 Plant Total RNA Isolation Kit Plus法提取的RNA电泳图7
图5草莓DELLA基因克隆与过量表达载体构建8
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
表1引物序列4
草莓DELLA蛋白的分析与克隆鉴定
引言
植物从种子萌发到果实成熟的整个生命循环过程受到许多内源因子的调节。赤霉素(GA)作为一种重要的生长激素，能够调控植物胚根的生长、茎杆的伸长、叶片的延展、花的发育、植物次生代谢产物的合成、花器的分化和果实的成熟等各个方面[1]。在以上几个方向中，GA的最显著的调控方向是对植物株型的调控，外施GA或者植物体内GA浓度升高时可以使植物的茎干伸长，而当植物感受不到GA信号时，则产生矮化的表型。如在草莓的营养生长阶段，外施GA可以促进草莓匍匐茎的生长，而在着果阶段，施加GA可以促进花梗和叶柄的伸长，从而防止因植株生长过于紧簇而引起的病害。用GA处理后的草莓植株，其匍匐茎的数量显著提高，同时也使叶片数增加,而且使单个叶片的大小也明显增大。另外，GA对保护地草莓有打破休眠、促进植株发育、提早物候期和采收提前的作用，而且植株生长整齐，无矮化现象。
作为重要的植物生长调节剂，GA的作用机理在拟南芥、水稻等模式植物中已经研究的比较清楚，目前许多GA 合成与信号传导通路中的关键因子均已被分离鉴定。其中包括GA 合成途径的关键酶GA13oxidase ，GA20 oxidase ，GA3 oxidase 和GA2 oxidase ，GA 受体GID1(GIBBERELLININSENSITIVEDWARF1)，DELLA 蛋白以及Fbox 蛋白SLY1/GID2 等。
作为GA信号传导途径中的重要调控因子，DELLA蛋白在GA信号通路中起到承上启下的关键作用。是GA信号传导过程中的关键负调控因子，在GA信号传导过程中发挥阻遏作用，几乎抑制所有依赖GA的植物生长过程。它的积累会阻遏植物生长，其突变体的典型特征为植株矮化、迟花以及叶片深绿色[2]。
目前，已经在多种植物中鉴定并克隆到了DELLA 蛋白，拟南芥基因组中共有5个编码 DELLA 蛋白的基因，它们分别是：RGA(REPRESSOR of GA13)、GAI ( GIBBERELLIN INSENSITIVE ) 、RGL1 ( RGA Like1 ) 、RGL2 和 RGL3 [3]。它们均定位在细胞核，功能上冗余，但仍存在部分差异，RGA 与GAI 抑制植物的营养生长和诱导成花，RGL2 抑制种子萌发，RGA、RGL1、RGL2 三者共同调控花序发育而RGL3 则与植物对环境胁迫的适应有关[4]。研究还发现DELLA蛋白除了调控植物株型外还能够调控花青苷的合成，拟南芥中DELLA蛋白能够促进花青苷的合成。
DELLA蛋白属于植物特异的GRAS家族成员，不同植物中发现的DELLA蛋白在结构上均高度保守，在其蛋白序列的N端具有保守的DELLA结构域（包括DELLA 和VHYNP 两个酸性基序），其C端则为具有转录调节功能的GRAS结构域，在这一结构域中同样含有一些保守的基序，如LHRI，LHRII，VHIID, PFYRE 和SAW [5]。当GA受体GID1与有生物活性的GA结合后导致GID1改变构象，通过N端与DELLA蛋白的DELLA结构域结合，形成GAGID1DELLA复合体，DELLA结构域对复合体的形成是必需的，缺失掉结构域的DELLA蛋白不能与GID1相互作用，即使存在有活性的GA也不能形成复合体[6,7]。随后，GAGID1复合体促进DELLA蛋白同SCFGID2/SLY1E3连接酶蛋白复合体特异地发生亲和反应，并最终通过26S蛋白酶体降解DELLA蛋白，从而解除DELLA蛋白的阻遏作用，完成赤霉素信号反应[8]。
作为GA信号传导途径中的关键负调控因子，一直以来，DELLA蛋白都是植物激素信号通路的研究热点之一。由于定位于细胞核而且能够调控其它基因的表达，以前一直认为DELLA蛋白是一类转录因子，但在DELLA蛋白的序列中并不含有DNA结合域，染色质免疫共沉淀(ChIP)实验也表明DELLA富集DNA的能力并不强。因此，人们推测DELLA可能与其它转录因子结合而调控下游基因的表达，2008年Feng和Lucas等人发现，DELLA蛋白RGA通过与光敏色素作用因子(phytochromeinteractingfactors，PIFs)PIF3/PIF4的互作调控拟南芥下胚轴的生长[9,10]。2013年Bai等人进一步研究发现，在调控拟南芥下胚轴伸长反应中还需要油菜素内酯(Brassinolide，BR)信号通路中的关键基因BZR1的参与，表明植物能够将BR，光信号与GA信号通路整合在一起调控植物的生长[11]。同样的调控方式还在GA调控茉莉酸(jasmonic acid，JA)信号反应和促进植物开花过程中被发现；拟南芥DELLA 蛋白结合JA信号途径中的转录抑制因子JAZ1从而释放MYC2，激活依赖于MYC2的下游JA响应基因的表达，而当GA存在时，DELLAs 被降解，JAZs 与MYC2 结合，抑制MYC2 下游JA 响应基因的表达[12]。
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