利用BSA法筛选与玉米粗缩病抗性相关的SSR分子标记
目 录
英文缩略词 1
1 引言 2
2 材料与方法 3
2.1 供试材料 3
2.2 群体家系对粗缩病抗性表型鉴定 3
2.3 玉米粗缩病分级标准及病情指数计算 3
2.4 BSA法建池 4
2.5 基因型分析 4
2.6 数据分析 4
3 结果与分析 4
3.1 亲本间多态性SSR标记筛选 4
3.2多态性SSR标记用于BSA池筛选 5
3.3标记ZM050在RIL群体中的验证 7
4 讨论 8
结论 10
致谢 11
参考文献 12
英文缩略词
Abbreviation
QTL：Quantitative trait locus 数量性状位点
MRDD：Maize Rough Dwarf Disease 玉米粗缩病
MRDV：Maize Rough Dwarf Virus 玉米粗缩病病毒
dNTP：deoxy-ribonucleoside triphosphate 三磷酸脱氧核糖核苷
SSR：Simple Sequence Repeats 简单序列重复
DNA：Deoxyribonucleic Acid 脱氧核糖核酸
cM：centimorgan *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
厘摩尔根
PCR：Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应
1 引言
玉米是我国主要的粮食作物、饲料作物，在近几十年来得生产过程中发展相当迅猛，无论是播种面积、单产，还是总产量都呈现稳定增长的趋势。然而，随着种植制度和种植结构的改变以及全球气候变暖等因素的影响，玉米生产上也出现了一些问题，各种病害发生加剧，玉米粗缩病就是其中之一，严重阻碍了玉米生产的发展。
玉米粗缩病(MRDV)是由玉米粗缩病毒（Maize Rough Dwarf Virus）所引起的一种病毒病。玉米粗缩病的危害除了使株高显著降低外，最终表现在玉米的经济产量上。发病轻者雄穗发育不良，散粉少，雌穗稍短；重者雄穗不能抽出，雌穗畸形不结实或结实极少。该病一旦暴发流行，则会造成重大的损失，甚至绝产。近几年，玉米粗缩病的发生具有明显上升的趋势，已成为江苏省和我国黄淮海夏玉米区生产中的最主要病害之一。
玉米粗缩病流行的主要原因是由于目前国内生产上大面积种植的玉米品种中大部分对玉米粗缩病中感或高感，且缺乏抗病品种。因此，在拓宽玉米种质基础的前提下，充分挖掘抗病基因资源，开展抗病遗传研究以及抗病育种工作是解决玉米粗缩病的危害、保证玉米高产、稳产的根本途径。国内一些学者已经开展了玉米粗缩病抗性资源筛选研究（郭启唐 等，1995；刘志增 等，1996；王安乐 等，1998；陈艳萍 等，2007），并筛选出一批抗或高抗粗缩病的种质，多集中在PB群。
鉴定于PB群种质抗粗缩病重要性，先后有国内开展PB种质抗粗缩病基因位点定位研究（陈永坤 2006；王飞 2007；陈艳萍 等，2008； Shi et al., 2012; Tao et al., 2013; Liu et al., 2014）。这些研究均针对X178、90110、豫自8701等。这些研究也同时表明，不同的PB种质可能含有不同的抗性基因。
BSA法(集群分离分析法)的原理是将分离群体中的个体依据研究的目标性状（如抗病和感病）分成两组，在每组群体中把各个个体的DNA等量混合，形成两个DNA混合池。由于分组时只对目标性状进行选择，所以两个DNA混合池在理论上主要在目标基因区段存在差异，因此，BSA法又称近等基因池法。
江苏省农科院粮食作物研究所近年来对本单位保存和引进的玉米种质资源进行系统的抗粗缩病筛选和抗性评价，筛选出一批以齐319为代表的对玉米粗缩病抗性优良的PB类群自交系。利用BSA法期望筛选出齐319抗玉米粗缩病基因位点的相关染色体区段，从而为进一步开发相关分子标记、开展分子标记辅助选择、抗性基因进一步精细定位乃至克隆奠定基础，最终服务于玉米抗粗缩病育种。
2材料与方法
2.1 供试材料
优良高配合力、高产玉米自交系苏951（高感粗缩病）由江苏省农业科学院提供；玉米自交系齐319（高抗粗缩病）引自山东省农业科学院。齐319与苏951在历年粗缩病鉴定结果如表1。2014年春季组配苏951和齐319的杂交种F1，2014年冬天在海南种植F1种子并自交加代得到F2代种子。2015年夏天在江苏丰县种植F2代。
表1 不同年份两个亲本在自然条件下粗缩病的病情指数
年份 齐319 苏951
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
/> 2013 22.6±8.4 74.8±15.1
2014 1.5±0.2 26.6±4.3
2015 7.4±1.4 56.2±5.3
2.2 群体家系对粗缩病抗性表型鉴定
江苏丰县是玉米粗缩病重发、常发区。灰飞虱携带的水稻黑条矮缩病毒是玉米粗缩病发生的病原。为了使玉米易感期（1～4叶期）与灰飞虱迁飞高峰相吻合，于5月22日播种F2代群体。田间单粒播种，共种植300株（最后留苗291株），株距0.2米，密度4500株/亩。同时播种亲本苏951和齐319各15株。播种前后不喷施任何内吸性杀虫剂，其它田间管理同一般大田生产。
2.3 玉米粗缩病分级标准及病情指数计算
于抽雄散粉后调查植株发病情况，并测量株高。根据发病情况和株高将玉米单株对抗粗缩病性分为0～4级标准。
性状鉴定与记载：于抽雄散粉后调查植株发病情况，并测量株高。根据发病情况和株高将玉米对粗缩病抗性分为0～4级标准，如下:
0级：健株。
1级：株高为健株株高的4/5左右，仅上部几个叶片叶背面有白色蜡泪状突起。
2级：株高为健株株高的2/3左右，整株显症。
3级：株高为健株株高的1/2左右，整株显症。
4级：株高为健株株高的1/3以下，整株显症或提早枯死。
病情指数=[∑(植株各级病株数×相应级别)/(总株数×最高级别)]×100
2.4 BSA法建池
根据玉米抽雄散粉后调查的植株发病情况，随机选取F2群体中健株即0级的单株12株叶片等量混合，抗池记为R1；随机选取抗性表现为4级的单株12株叶片等量混合，感池记为S1；此建池过程重复2次，抗、感池分别记为R2、S2。
2.5 基因型分析
参照已经发表的玉米分子连锁图，从Maize GDB（http://www.maizegdb.org）选取均匀覆盖全基因组的516对引物，根据MaizeGDB公布的引物序列，由上海英俊生物公司合成。DNA的提取用简易CTAB抽提法进行。抽提的DNA经Thermo公司的NanoDrop 2000测定浓度并调整所有供试样品的DNA浓度至40ng/ul，随后放置于-20℃冰箱保存或4℃冰箱中冷藏备用。PCR扩增时采用10μl反应体系，包括0.15 μM的引物、200 μM dNTP、1×PCR反应缓冲液(50mM KCl、10mM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl2)、60ng的DNA模板、0.5 U Taq酶。反应在朗基公司的MG96+型PCR仪中进行。
英文缩略词 1
1 引言 2
2 材料与方法 3
2.1 供试材料 3
2.2 群体家系对粗缩病抗性表型鉴定 3
2.3 玉米粗缩病分级标准及病情指数计算 3
2.4 BSA法建池 4
2.5 基因型分析 4
2.6 数据分析 4
3 结果与分析 4
3.1 亲本间多态性SSR标记筛选 4
3.2多态性SSR标记用于BSA池筛选 5
3.3标记ZM050在RIL群体中的验证 7
4 讨论 8
结论 10
致谢 11
参考文献 12
英文缩略词
Abbreviation
QTL：Quantitative trait locus 数量性状位点
MRDD：Maize Rough Dwarf Disease 玉米粗缩病
MRDV：Maize Rough Dwarf Virus 玉米粗缩病病毒
dNTP：deoxy-ribonucleoside triphosphate 三磷酸脱氧核糖核苷
SSR：Simple Sequence Repeats 简单序列重复
DNA：Deoxyribonucleic Acid 脱氧核糖核酸
cM：centimorgan *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
厘摩尔根
PCR：Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应
1 引言
玉米是我国主要的粮食作物、饲料作物，在近几十年来得生产过程中发展相当迅猛，无论是播种面积、单产，还是总产量都呈现稳定增长的趋势。然而，随着种植制度和种植结构的改变以及全球气候变暖等因素的影响，玉米生产上也出现了一些问题，各种病害发生加剧，玉米粗缩病就是其中之一，严重阻碍了玉米生产的发展。
玉米粗缩病(MRDV)是由玉米粗缩病毒（Maize Rough Dwarf Virus）所引起的一种病毒病。玉米粗缩病的危害除了使株高显著降低外，最终表现在玉米的经济产量上。发病轻者雄穗发育不良，散粉少，雌穗稍短；重者雄穗不能抽出，雌穗畸形不结实或结实极少。该病一旦暴发流行，则会造成重大的损失，甚至绝产。近几年，玉米粗缩病的发生具有明显上升的趋势，已成为江苏省和我国黄淮海夏玉米区生产中的最主要病害之一。
玉米粗缩病流行的主要原因是由于目前国内生产上大面积种植的玉米品种中大部分对玉米粗缩病中感或高感，且缺乏抗病品种。因此，在拓宽玉米种质基础的前提下，充分挖掘抗病基因资源，开展抗病遗传研究以及抗病育种工作是解决玉米粗缩病的危害、保证玉米高产、稳产的根本途径。国内一些学者已经开展了玉米粗缩病抗性资源筛选研究（郭启唐 等，1995；刘志增 等，1996；王安乐 等，1998；陈艳萍 等，2007），并筛选出一批抗或高抗粗缩病的种质，多集中在PB群。
鉴定于PB群种质抗粗缩病重要性，先后有国内开展PB种质抗粗缩病基因位点定位研究（陈永坤 2006；王飞 2007；陈艳萍 等，2008； Shi et al., 2012; Tao et al., 2013; Liu et al., 2014）。这些研究均针对X178、90110、豫自8701等。这些研究也同时表明，不同的PB种质可能含有不同的抗性基因。
BSA法(集群分离分析法)的原理是将分离群体中的个体依据研究的目标性状（如抗病和感病）分成两组，在每组群体中把各个个体的DNA等量混合，形成两个DNA混合池。由于分组时只对目标性状进行选择，所以两个DNA混合池在理论上主要在目标基因区段存在差异，因此，BSA法又称近等基因池法。
江苏省农科院粮食作物研究所近年来对本单位保存和引进的玉米种质资源进行系统的抗粗缩病筛选和抗性评价，筛选出一批以齐319为代表的对玉米粗缩病抗性优良的PB类群自交系。利用BSA法期望筛选出齐319抗玉米粗缩病基因位点的相关染色体区段，从而为进一步开发相关分子标记、开展分子标记辅助选择、抗性基因进一步精细定位乃至克隆奠定基础，最终服务于玉米抗粗缩病育种。
2材料与方法
2.1 供试材料
优良高配合力、高产玉米自交系苏951（高感粗缩病）由江苏省农业科学院提供；玉米自交系齐319（高抗粗缩病）引自山东省农业科学院。齐319与苏951在历年粗缩病鉴定结果如表1。2014年春季组配苏951和齐319的杂交种F1，2014年冬天在海南种植F1种子并自交加代得到F2代种子。2015年夏天在江苏丰县种植F2代。
表1 不同年份两个亲本在自然条件下粗缩病的病情指数
年份 齐319 苏951
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
/> 2013 22.6±8.4 74.8±15.1
2014 1.5±0.2 26.6±4.3
2015 7.4±1.4 56.2±5.3
2.2 群体家系对粗缩病抗性表型鉴定
江苏丰县是玉米粗缩病重发、常发区。灰飞虱携带的水稻黑条矮缩病毒是玉米粗缩病发生的病原。为了使玉米易感期（1～4叶期）与灰飞虱迁飞高峰相吻合，于5月22日播种F2代群体。田间单粒播种，共种植300株（最后留苗291株），株距0.2米，密度4500株/亩。同时播种亲本苏951和齐319各15株。播种前后不喷施任何内吸性杀虫剂，其它田间管理同一般大田生产。
2.3 玉米粗缩病分级标准及病情指数计算
于抽雄散粉后调查植株发病情况，并测量株高。根据发病情况和株高将玉米单株对抗粗缩病性分为0～4级标准。
性状鉴定与记载：于抽雄散粉后调查植株发病情况，并测量株高。根据发病情况和株高将玉米对粗缩病抗性分为0～4级标准，如下:
0级：健株。
1级：株高为健株株高的4/5左右，仅上部几个叶片叶背面有白色蜡泪状突起。
2级：株高为健株株高的2/3左右，整株显症。
3级：株高为健株株高的1/2左右，整株显症。
4级：株高为健株株高的1/3以下，整株显症或提早枯死。
病情指数=[∑(植株各级病株数×相应级别)/(总株数×最高级别)]×100
2.4 BSA法建池
根据玉米抽雄散粉后调查的植株发病情况，随机选取F2群体中健株即0级的单株12株叶片等量混合，抗池记为R1；随机选取抗性表现为4级的单株12株叶片等量混合，感池记为S1；此建池过程重复2次，抗、感池分别记为R2、S2。
2.5 基因型分析
参照已经发表的玉米分子连锁图，从Maize GDB（http://www.maizegdb.org）选取均匀覆盖全基因组的516对引物，根据MaizeGDB公布的引物序列，由上海英俊生物公司合成。DNA的提取用简易CTAB抽提法进行。抽提的DNA经Thermo公司的NanoDrop 2000测定浓度并调整所有供试样品的DNA浓度至40ng/ul，随后放置于-20℃冰箱保存或4℃冰箱中冷藏备用。PCR扩增时采用10μl反应体系，包括0.15 μM的引物、200 μM dNTP、1×PCR反应缓冲液(50mM KCl、10mM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl2)、60ng的DNA模板、0.5 U Taq酶。反应在朗基公司的MG96+型PCR仪中进行。
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