洋葱组织培养和多倍体诱导
摘要：洋葱是百合科葱属,是世界范围内普遍栽培的重要蔬菜之一。其营养丰富,并具有多种保健功能。洋葱的传统育种方法是常规育种，存在育种年限长，工作量大，育种效率低等难题，采用组织培养可以缩短年限，简化育种方法提高育种效率。多倍体现象广泛存在于植物界中，组织培养结合秋水仙素诱导植物多倍体的技术手段得以应用,并伴随组织培养技术的发展而日趋成熟。本研究以洋葱（Allium cepa L.）品种‘W470’幼苗时期带芽眼的鳞茎盘为外植体材料，研究其在秋水仙碱处理不同时间和不同浓度对洋葱四倍体诱导的影响，以期建立一种离体培养条件下诱导洋葱四倍体的方法体系。结果表明，含有0.02%的秋水仙素的BDS固体培养基处理48h诱导效果最为明显，成活率为48%，获得21株非玻璃化再生苗，经形态学观察及根尖倍性鉴定有4株为四倍体植株，四倍体诱导率为19.0%。本研究为诱导洋葱四倍体提供了一种操作简便、可行性高以及四倍体诱导率高的切实可行的方法，对丰富洋葱种质资源，提高洋葱经济效益具有积极意义。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言23
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2实验方法 3
1.3多倍体的鉴定
2结果与分析4
2.1秋水仙素对鳞茎生长点的影响4
2.2再生苗的获得45
2.3多倍体植株的获得与鉴定56
3.讨论67
致谢7
参考文献78
洋葱组织培养和多倍体诱导
园艺 黄鑫鑫
引言
引言
洋葱的育种主要通过常规育种为主，育种上存在育种周期长，工作量大等问题。组织培养技术可以缩短育种年限，提高育种效率，解决洋葱常规育种的一些问题。目前很多研究通过洋葱组织培养获得更多优良性状和种质资源,对缩小我国洋葱育种水平与世界先进水平的差距具有重要的意义，为选育出新优品种提供科学依据。洋葱的组织培养主要有器官发生和体细胞胚胎发生两种途径, 器官发生型途径是指外植体经过脱分化产生愈伤组织,再分化产生不定芽
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
,或直接从外植体上再生不定芽,再生成完整植株的过程,分别称为间接和直接器官发生型。 Luthar和Bohanec[1]采用两步法培养花蕾和子房,直接在外植体上诱导产生不定芽。减少了变异,其中花蕾的不定芽诱导率最高达到57.2%。通过外植体诱导形成愈伤组织,经过再分化过程形成不定芽,获得再生植株也有报道。 杜敏霞和刘湘萍[2]以洋葱幼蕾为外植体,建立了愈伤诱导率为85.7%,出芽率为65%的再生体系。植物体细胞胚胎发生型是指单倍体或双倍体的植物体细胞在特定条件下,未经细胞融合而通过与合子胚胚胎发生相类似的途径发育出新个体的形态发生过程。体细胞胚胎发生型最早是在洋葱愈伤组织上观察到 [3]。Phillips和Luteyn [4]以萌发的种子为外植体,获得了体细胞胚,但是诱导率较低,只有7%。Saker [5]以成熟种子为外植体,在MS培养基上添加2 mg/L的 2,4D获得胚性愈伤组织,添加1 mg/L的 KT的培养基上培养,愈伤组织表面上产生体细胞胚并获得再生苗。姜聰琰[6]用洋葱花蕾为外植体,在 2 mg* L12，4D + 2 mg* L1 6BA + 1 mg* L1KT + 0.5 mg* L1NAA的MS培养基上,愈伤组织的最高诱导率为41.11%,培养得到了胚性愈伤组织和胚状体,获得了洋葱再生植株。另外还有关于单倍体诱导、原生质体培养、体细胞融合等洋葱细胞培养的研究报道[725]。洋葱组织培养主要以幼嫩花蕾、未成熟胚、种子、子房、根部、鳞茎、鳞茎盘等组织器官为外植体,获得再生苗,建立再生体系[26]。影响洋葱再生体系建立的因素有许多,非常复杂。如受试品种的基因型、外植体因素、培养基营养成分、生长调节剂配比、光温等，关于这一方面也有很多研究报道。Luciani等[27] 在大蒜研究中发现,BDS优于MS基本培养基,培养基的选择应根据材料不同来选择。ZdravkovicKorac等[28]认为基本培养基对组织培养的影响不大,植物生长调节剂对愈伤组织的诱导和分化起到更为重要的作用。
洋葱的组织培养同样也存在着很多问题，比如再生体系存在再生率低,实验过程污染严重的特点,目前还未有适合的洋葱离体再生体系可以适用于转基因技术; 洋葱在离体再生过程中,极易产生变异,染色体倍性的不确定给科研和生产带来诸多不便。如何控制变异率,是今后研究的方向之一。自从第一次报道有关洋葱的单倍体离体培养以来,通过雌核发育途径诱导单倍体的技术取得了较大进展。但是目前这种单倍体诱导技术还存在许多问题, 因此需要进一步改良和完善。另外,更有效的小孢子培养技术尚未取得突破,这需要在发育胚胎学及分子生物学上加以研究。
我国洋葱种植面积和产量现均居世界第一位,但我国洋葱栽培历史比较短,种质资源相对匮乏,育种水平与国际先进水平尚有很大的差距,迫切的需求给我们提出了更高的要求和挑战。利用组织培养技术可以有效提高育种率,缩短育种年限,获得更多的优良性状,有效解决洋葱在育种上存在的一些问题,改善我国洋葱育种研究现状。
1 材料与方法
1.1材料
（1）药品试剂。秋水仙碱、BDS培养基 、6苄氨基腺嘌呤（6BA）、萘乙酸（NAA）、二甲基亚砜（DMSO）
（2）试剂配制。1%的秋水仙碱母液：称1g秋水仙素碱，溶解在2%二甲基亚砜（DMSO）中，再加蒸馏水稀释至100ml。
（3）洋葱。供试材料为W470，由大学园艺站提供，实验在大学作物遗传与种质创新国家重点实验室组培室进行。
（4）基础培养基。均使用固体BDS培养基为基本培养基，添加不同的植物激素，蔗糖3%，琼脂0.75%，调pH值至5.75.8。
1.2 实验方法及步骤
（1） 技术路线
洋葱材料→消毒→取其鳞茎盘→加诱导剂培养→发芽培养→生根培养→培养成苗→检测倍性→大田移栽
（2）前期处理
三月中旬从农场采集的洋葱经初步处理以后放入4℃冰箱饥饿处理5d， 随后将冷藏洋葱球剥除外皮至直径为1.5cm左右的小葱球，用自来水冲洗30 min，拿至超净工作台，用 75%酒精浸泡 3 min（摇晃），再用无菌水冲洗 5 次后。再次将外皮剥尽，留下鳞茎盘，用10%次氯酸钠溶液浸泡15min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分，在无菌条件下用消过毒的手术刀将洋葱切除至鳞茎盘为 1～2 mm 厚、贴近鳞茎盘的鳞茎长、宽各为 4～5 mm、高为 1.0～1.5 mm并带有一个肉眼可观的芽眼外植体。
（3）加秋水仙素培养
固体培养基：转入含有秋水仙碱浓度分别为0、 0.010%、0.015%、0.020%的愈伤组织诱导培养基（BDS + 0.35 mgL1NAA + 0.9 mgL16BA）中，处理时间分别为24h、48h，共8个组合，每个组合100粒洋葱鳞茎盘。培养温度(22±1)℃，光照强度2000 lx，光照时14 hd1，RH为90%。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言23
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2实验方法 3
1.3多倍体的鉴定
2结果与分析4
2.1秋水仙素对鳞茎生长点的影响4
2.2再生苗的获得45
2.3多倍体植株的获得与鉴定56
3.讨论67
致谢7
参考文献78
洋葱组织培养和多倍体诱导
园艺 黄鑫鑫
引言
引言
洋葱的育种主要通过常规育种为主，育种上存在育种周期长，工作量大等问题。组织培养技术可以缩短育种年限，提高育种效率，解决洋葱常规育种的一些问题。目前很多研究通过洋葱组织培养获得更多优良性状和种质资源,对缩小我国洋葱育种水平与世界先进水平的差距具有重要的意义，为选育出新优品种提供科学依据。洋葱的组织培养主要有器官发生和体细胞胚胎发生两种途径, 器官发生型途径是指外植体经过脱分化产生愈伤组织,再分化产生不定芽
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
,或直接从外植体上再生不定芽,再生成完整植株的过程,分别称为间接和直接器官发生型。 Luthar和Bohanec[1]采用两步法培养花蕾和子房,直接在外植体上诱导产生不定芽。减少了变异,其中花蕾的不定芽诱导率最高达到57.2%。通过外植体诱导形成愈伤组织,经过再分化过程形成不定芽,获得再生植株也有报道。 杜敏霞和刘湘萍[2]以洋葱幼蕾为外植体,建立了愈伤诱导率为85.7%,出芽率为65%的再生体系。植物体细胞胚胎发生型是指单倍体或双倍体的植物体细胞在特定条件下,未经细胞融合而通过与合子胚胚胎发生相类似的途径发育出新个体的形态发生过程。体细胞胚胎发生型最早是在洋葱愈伤组织上观察到 [3]。Phillips和Luteyn [4]以萌发的种子为外植体,获得了体细胞胚,但是诱导率较低,只有7%。Saker [5]以成熟种子为外植体,在MS培养基上添加2 mg/L的 2,4D获得胚性愈伤组织,添加1 mg/L的 KT的培养基上培养,愈伤组织表面上产生体细胞胚并获得再生苗。姜聰琰[6]用洋葱花蕾为外植体,在 2 mg* L12，4D + 2 mg* L1 6BA + 1 mg* L1KT + 0.5 mg* L1NAA的MS培养基上,愈伤组织的最高诱导率为41.11%,培养得到了胚性愈伤组织和胚状体,获得了洋葱再生植株。另外还有关于单倍体诱导、原生质体培养、体细胞融合等洋葱细胞培养的研究报道[725]。洋葱组织培养主要以幼嫩花蕾、未成熟胚、种子、子房、根部、鳞茎、鳞茎盘等组织器官为外植体,获得再生苗,建立再生体系[26]。影响洋葱再生体系建立的因素有许多,非常复杂。如受试品种的基因型、外植体因素、培养基营养成分、生长调节剂配比、光温等，关于这一方面也有很多研究报道。Luciani等[27] 在大蒜研究中发现,BDS优于MS基本培养基,培养基的选择应根据材料不同来选择。ZdravkovicKorac等[28]认为基本培养基对组织培养的影响不大,植物生长调节剂对愈伤组织的诱导和分化起到更为重要的作用。
洋葱的组织培养同样也存在着很多问题，比如再生体系存在再生率低,实验过程污染严重的特点,目前还未有适合的洋葱离体再生体系可以适用于转基因技术; 洋葱在离体再生过程中,极易产生变异,染色体倍性的不确定给科研和生产带来诸多不便。如何控制变异率,是今后研究的方向之一。自从第一次报道有关洋葱的单倍体离体培养以来,通过雌核发育途径诱导单倍体的技术取得了较大进展。但是目前这种单倍体诱导技术还存在许多问题, 因此需要进一步改良和完善。另外,更有效的小孢子培养技术尚未取得突破,这需要在发育胚胎学及分子生物学上加以研究。
我国洋葱种植面积和产量现均居世界第一位,但我国洋葱栽培历史比较短,种质资源相对匮乏,育种水平与国际先进水平尚有很大的差距,迫切的需求给我们提出了更高的要求和挑战。利用组织培养技术可以有效提高育种率,缩短育种年限,获得更多的优良性状,有效解决洋葱在育种上存在的一些问题,改善我国洋葱育种研究现状。
1 材料与方法
1.1材料
（1）药品试剂。秋水仙碱、BDS培养基 、6苄氨基腺嘌呤（6BA）、萘乙酸（NAA）、二甲基亚砜（DMSO）
（2）试剂配制。1%的秋水仙碱母液：称1g秋水仙素碱，溶解在2%二甲基亚砜（DMSO）中，再加蒸馏水稀释至100ml。
（3）洋葱。供试材料为W470，由大学园艺站提供，实验在大学作物遗传与种质创新国家重点实验室组培室进行。
（4）基础培养基。均使用固体BDS培养基为基本培养基，添加不同的植物激素，蔗糖3%，琼脂0.75%，调pH值至5.75.8。
1.2 实验方法及步骤
（1） 技术路线
洋葱材料→消毒→取其鳞茎盘→加诱导剂培养→发芽培养→生根培养→培养成苗→检测倍性→大田移栽
（2）前期处理
三月中旬从农场采集的洋葱经初步处理以后放入4℃冰箱饥饿处理5d， 随后将冷藏洋葱球剥除外皮至直径为1.5cm左右的小葱球，用自来水冲洗30 min，拿至超净工作台，用 75%酒精浸泡 3 min（摇晃），再用无菌水冲洗 5 次后。再次将外皮剥尽，留下鳞茎盘，用10%次氯酸钠溶液浸泡15min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分，在无菌条件下用消过毒的手术刀将洋葱切除至鳞茎盘为 1～2 mm 厚、贴近鳞茎盘的鳞茎长、宽各为 4～5 mm、高为 1.0～1.5 mm并带有一个肉眼可观的芽眼外植体。
（3）加秋水仙素培养
固体培养基：转入含有秋水仙碱浓度分别为0、 0.010%、0.015%、0.020%的愈伤组织诱导培养基（BDS + 0.35 mgL1NAA + 0.9 mgL16BA）中，处理时间分别为24h、48h，共8个组合，每个组合100粒洋葱鳞茎盘。培养温度(22±1)℃，光照强度2000 lx，光照时14 hd1，RH为90%。
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