菊花rna聚合酶iictd磷酸酶1基因cmcpl1的克隆与表达分析
摘要：从‘神马’菊花的转录组数据库中检索获得菊花RNA聚合酶II CTD磷酸酶（CPL1）的部分序列，进而利用 RT-PCR 和RACE技术从 ‘神马’菊花中克隆得到CPL1基因序列，命名为CmCPL1。该基因cDNA全长3 159 bp，编码955个氨基酸，推测分子量为106.91kD，理论等电点为6.02。结构域分析表明，该基因编码蛋白包含两个双链RNA结合域和一个典型的RNA聚合酶II CTD磷酸酶催化结构域，属于FCP1类激酶因子；系统进化树分析表明，CmCPL1与茄科的马铃薯StCPL1和番茄SlCPL1的亲缘关系最近，具有相同的起源。QRT-PCR结果显示，CmCPL1在不同组织器官中均有表达，其中叶片中表达量最高，其次为花、根和茎。此外，菊花CmCPL1可以被高盐、低温、干旱、ABA、缺铁等非生物胁迫诱导，且ABA、干旱和缺铁胁迫下CmCPL1的表达量呈现出周期性变化趋势，表明其可能通过调控RNA聚合酶II磷酸化和去磷酸化水平的周期性变化从而参与菊花对各种非生物胁迫的响应。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words4
引言4
1材料与方法4
1.1植物材料处理与方法4
1.2总RNA的提取合cDNA合成4
1.3菊花CmCPL1的克隆5
1.4 CmCPL1生物信息学分析5
1.5 CmCPL1的荧光定量PCR分析5
1.6数据分析与图片处理6
2结果与分析6
2.1 CmCPL1基因克隆与序列分析6
2.2 CmCPL1 编码蛋白的生物信息学分析6
2.3 系统进化树分析7
2.4 CmCPL1的荧光定量表达分析8
3讨论9
致谢10
参考文献10
表 1 5
图 1 6
图 2 7
图 3 7
图 4 8
图 5 9
菊花RNA聚合酶II CTD磷酸酶1基因CmCPL1的克隆与表达分析
引言
菊花(Chrysanthe
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
mum morifolium)是我国十大传统名花和世界四大切花之一，具有很高的观赏和应用价值，在花卉生产中占有十分重要的地位。然而，菊花对干旱、低温、盐碱及蚜虫等生物和非生物胁迫较为敏感，严重影响菊花的产量和品质[1]。因此，发掘菊花的抗逆基因并了解其作用机制，对培育抗性较高的菊花品种具有重要意义。
RNA聚合酶II CTD磷酸酶1（RNA polymerase II CTDphosphataselike 1，CPL1）也称为FRY2，其在调控RNA聚合酶II上最大亚基末端的羧基端结构域（Carboxyl Terminal Domain，CTD）磷酸化水平中发挥重要作用[2]，进而影响下游功能基因的转录表达[3]。现有的研究表明，植物的CPL1包含一个磷酸酶催化结构域和两个dsRNA结合域以及一个核定位信号，其在调控胁迫应答基因的表达中扮演重要角色[2, 4]。目前，植物中关于CPL1功能的研究较少，且主要集中在模式植物拟南芥上。其中，Xiong 等[5]的研究表明，非生物胁迫下FRY2对DRE/CRT家族基因和CBF/DREB家族基因的表达具有重要的负调控作用；而Guan等[6]的研究显示，AtCPL1的等位基因RCF2通过调控相关基因的表达提高了拟南芥的高温耐受性，Jiang等[7]的研究表明AtCPL1/FRY2与KH结构域蛋白SHI1相互作用以调控拟南芥对冷胁迫和ABA的响应；类似的，KH结构域蛋白RCF3亦被证实其与AtCPL1互作并参与拟南芥非生物胁迫信号的调控[8]，而Chen等[9]的研究则表明AtCPL1基因可能通过补充特定RNA加工转录因子来调控初期转录过程以应对环境胁迫；此外，缺铁条件下AtCPL1可以诱导提高铁利用相关基因的表达从而参与对拟南芥Fe吸收、分配和利用过程的调控[10]。然而，其他植物中关于CPL1的研究相对滞后，其参与植物逆境响应的作用机制尚不清楚。
本研究从切花菊‘神马’中克隆得到了CmCPL1基因的cDNA全长序列，利用生物信息学手段初步分析了该基因及其编码蛋白的结构和功能，并通过实时荧光定量PCR技术分析了该基因在多种非生物胁迫下的表达模式，以探究CmCPL1与菊花抗逆性的关系，为通过基因工程手段培育具抗逆性菊花品种提供候选基因资源，为菊花分子育种提供理论依据。
1 材料与方法
1.1植物材料与处理
供试材料为 ‘神马’品种切花菊，保存于大学“中国菊花种质资源保存中心”。胁迫处理试验于2013年8月在大学园艺学院进行，剪取长势一致的‘神马’插穗扦插于基质中（珍珠岩：营养土：蛭石=1:3:5，v/v/v），并将扦插苗置于温室中进行培养，培养条件为：昼夜温度25 ℃/22 ℃，光周期12 h/12 h，光照强度为300 μmolm2s1，相对湿度70% ~ 80%。待扦插苗生根后用清水将植株清洗干净，并置于基础营养液中预培养两周后进行不同的胁迫处理，包括低温（4 ℃）、NaCl（200 mmolL1）、ABA（50 mmolL1叶面喷施，对照组配施去离子水）、PEG 6000（20%）和缺铁处理（FeEDTA 0 μmolL1），基础营养液成分为：KNO3 1.67 mmolL1、KH2PO4 300 μmolL1、MgSO4250 μmolL1、K2SO4 300 μmolL1、CaCl2 750 μmolL1、FeEDTA 15 μmolL1、H3BO3 45 μmolL1、MnCl2 4.5 μmolL1、ZnSO4 1 μmolL1、H2MoO4 0.13 μmolL1、CuSO4 0.16 μmolL1， pH = 5.8[11]。分别于0、1、3、9、12和24 h 对各处理和对照进行取样，低温和ABA处理的取样部位为幼嫩叶片，而NaCl、PEG 6000和缺铁处理的取样部位为根，将所取材料置于液氮中速冻，–80 ℃冰箱保存备用。每个处理均设3次重复。
分别采集‘神马’品种切花菊的根、茎、叶、花（管状花和舌状花分别采集，2013年11月采样），并将所取材料置于液氮中速冻，80 ℃冰箱保存，用于基因的组织特异性表达分析。
1.2 总RNA 的提取和cDNA 合成
用RNAiso Plus （TaKaRa，Japan）提取采集保存的‘神马’菊花组织材料的总RNA，并用DNAase（Recombinant DNase I，RNasefree，TaKaRa）去除基因组DNA污染。用 ONE DropTM OD1000 + Spectrophotometer（ONE Drop，USA）检测 RNA 浓度和质量，琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性和稳定性。使用 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，Dalian）合成cDNA。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words4
引言4
1材料与方法4
1.1植物材料处理与方法4
1.2总RNA的提取合cDNA合成4
1.3菊花CmCPL1的克隆5
1.4 CmCPL1生物信息学分析5
1.5 CmCPL1的荧光定量PCR分析5
1.6数据分析与图片处理6
2结果与分析6
2.1 CmCPL1基因克隆与序列分析6
2.2 CmCPL1 编码蛋白的生物信息学分析6
2.3 系统进化树分析7
2.4 CmCPL1的荧光定量表达分析8
3讨论9
致谢10
参考文献10
表 1 5
图 1 6
图 2 7
图 3 7
图 4 8
图 5 9
菊花RNA聚合酶II CTD磷酸酶1基因CmCPL1的克隆与表达分析
引言
菊花(Chrysanthe
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
mum morifolium)是我国十大传统名花和世界四大切花之一，具有很高的观赏和应用价值，在花卉生产中占有十分重要的地位。然而，菊花对干旱、低温、盐碱及蚜虫等生物和非生物胁迫较为敏感，严重影响菊花的产量和品质[1]。因此，发掘菊花的抗逆基因并了解其作用机制，对培育抗性较高的菊花品种具有重要意义。
RNA聚合酶II CTD磷酸酶1（RNA polymerase II CTDphosphataselike 1，CPL1）也称为FRY2，其在调控RNA聚合酶II上最大亚基末端的羧基端结构域（Carboxyl Terminal Domain，CTD）磷酸化水平中发挥重要作用[2]，进而影响下游功能基因的转录表达[3]。现有的研究表明，植物的CPL1包含一个磷酸酶催化结构域和两个dsRNA结合域以及一个核定位信号，其在调控胁迫应答基因的表达中扮演重要角色[2, 4]。目前，植物中关于CPL1功能的研究较少，且主要集中在模式植物拟南芥上。其中，Xiong 等[5]的研究表明，非生物胁迫下FRY2对DRE/CRT家族基因和CBF/DREB家族基因的表达具有重要的负调控作用；而Guan等[6]的研究显示，AtCPL1的等位基因RCF2通过调控相关基因的表达提高了拟南芥的高温耐受性，Jiang等[7]的研究表明AtCPL1/FRY2与KH结构域蛋白SHI1相互作用以调控拟南芥对冷胁迫和ABA的响应；类似的，KH结构域蛋白RCF3亦被证实其与AtCPL1互作并参与拟南芥非生物胁迫信号的调控[8]，而Chen等[9]的研究则表明AtCPL1基因可能通过补充特定RNA加工转录因子来调控初期转录过程以应对环境胁迫；此外，缺铁条件下AtCPL1可以诱导提高铁利用相关基因的表达从而参与对拟南芥Fe吸收、分配和利用过程的调控[10]。然而，其他植物中关于CPL1的研究相对滞后，其参与植物逆境响应的作用机制尚不清楚。
本研究从切花菊‘神马’中克隆得到了CmCPL1基因的cDNA全长序列，利用生物信息学手段初步分析了该基因及其编码蛋白的结构和功能，并通过实时荧光定量PCR技术分析了该基因在多种非生物胁迫下的表达模式，以探究CmCPL1与菊花抗逆性的关系，为通过基因工程手段培育具抗逆性菊花品种提供候选基因资源，为菊花分子育种提供理论依据。
1 材料与方法
1.1植物材料与处理
供试材料为 ‘神马’品种切花菊，保存于大学“中国菊花种质资源保存中心”。胁迫处理试验于2013年8月在大学园艺学院进行，剪取长势一致的‘神马’插穗扦插于基质中（珍珠岩：营养土：蛭石=1:3:5，v/v/v），并将扦插苗置于温室中进行培养，培养条件为：昼夜温度25 ℃/22 ℃，光周期12 h/12 h，光照强度为300 μmolm2s1，相对湿度70% ~ 80%。待扦插苗生根后用清水将植株清洗干净，并置于基础营养液中预培养两周后进行不同的胁迫处理，包括低温（4 ℃）、NaCl（200 mmolL1）、ABA（50 mmolL1叶面喷施，对照组配施去离子水）、PEG 6000（20%）和缺铁处理（FeEDTA 0 μmolL1），基础营养液成分为：KNO3 1.67 mmolL1、KH2PO4 300 μmolL1、MgSO4250 μmolL1、K2SO4 300 μmolL1、CaCl2 750 μmolL1、FeEDTA 15 μmolL1、H3BO3 45 μmolL1、MnCl2 4.5 μmolL1、ZnSO4 1 μmolL1、H2MoO4 0.13 μmolL1、CuSO4 0.16 μmolL1， pH = 5.8[11]。分别于0、1、3、9、12和24 h 对各处理和对照进行取样，低温和ABA处理的取样部位为幼嫩叶片，而NaCl、PEG 6000和缺铁处理的取样部位为根，将所取材料置于液氮中速冻，–80 ℃冰箱保存备用。每个处理均设3次重复。
分别采集‘神马’品种切花菊的根、茎、叶、花（管状花和舌状花分别采集，2013年11月采样），并将所取材料置于液氮中速冻，80 ℃冰箱保存，用于基因的组织特异性表达分析。
1.2 总RNA 的提取和cDNA 合成
用RNAiso Plus （TaKaRa，Japan）提取采集保存的‘神马’菊花组织材料的总RNA，并用DNAase（Recombinant DNase I，RNasefree，TaKaRa）去除基因组DNA污染。用 ONE DropTM OD1000 + Spectrophotometer（ONE Drop，USA）检测 RNA 浓度和质量，琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性和稳定性。使用 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，Dalian）合成cDNA。
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