萝卜霜霉病抗性相关蛋白组学研究
摘要：萝卜（Raphanus sativus L.）为十字花科萝卜属一、二年生根菜类蔬菜作物，由寄生霜霉（Hyalonosporan parasitica）引起的霜霉病是十字花科作物的一种主要病害。感病品种‘NAU-BJQ’为实验材料，四叶期时接种霜霉菌，利用Tris-Hcl/TCA-丙酮法提取对照和处理后7d的叶片总蛋白。双向电泳后，结合PDQuest 8.0软件分析和肉眼观察，发现霜霉菌处理过的萝卜叶片相对于对照有24个蛋白点表现出明显的差异，并对其进行MALDI-TOF/TOF质谱分析。质谱鉴定结果显示，有22个差异蛋白获得成功鉴定。生物信息学分析表明，已鉴定的蛋白质参与了蛋白质合成和代谢以及稳定、糖和能量代谢、信号转导、抗性与调控相关等生命活动功能。利用qRT-PCR技术对2个上调蛋白和2个下调蛋白基因的表达情况进行分析，结果发现它们在接种霜霉菌后不同时期的表达水平不尽相同，但都与抗性密切相关。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料 2
1.2 病原菌的制备与接种处理 2
1.3 蛋白质的提取2
1.4 蛋白质的溶解2
1.5 双向电泳2
1.5.1 等电聚焦2
1.5.2 胶条的平衡3
1.5.3 SDSPAGE3
1.6 考马斯亮蓝染色 3
1.7 图像采集与分析3
1.8质谱分析与数据库检索3
1.9 编码差异蛋白基因的表达特征分析3
1.9.1 总RNA提取3
1.9.2 RNA纯化3
1.9.3 RNA检测4
1.9.4 RNA反转录4
1.9.5 引物设计与合成4
2 结果与分析5
2.1萝卜感染霜霉菌前后蛋白质双向电泳图谱分析5
2.2 差异蛋白点的质谱鉴定 7
2.3 差异调节蛋白质（多肽）的功能分类 8
2.4 编码差异蛋白基因的表达特征分析8
2.
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
4.1 RNA 提取检测8
2.4.2 差异基因表达分析9
3讨论9
3.1 蛋白质合成、代谢和稳定蛋白9
3.2 糖类和能量代谢相关蛋白 10
3.3 光合作用相关蛋白 10
3.4 抗性相关蛋白 11
3.5 调控蛋白 11
3.6 信号转导相关蛋白 11
致谢12
参考文献12
图1 叶片感染霜霉菌前后蛋白质双向电泳图谱6
图2 霜霉菌处理前后不同时期RNA电泳图8图3差异蛋白的基因表达分析9
表1 目的基因片段的引物设计5
表2 蛋白质 MALDITOFMS 分析结果7
萝卜霜霉病抗性相关蛋白质组学研究
引言
蛋白质组（Proteome）的概念是蛋白质（Protein）、基因组（Genome）两个词的融合，指基因组中所表达的全部蛋白质。蛋白质组学（Proteomics）是从整体水平上分析研究组织、细胞内变化的蛋白的成分、表达水平与修饰状态，进而了解细胞的各项功能、生理生化过程及对胁迫的反应过程，是揭示蛋白质功能与细胞生命活动的一个新兴领域（刘珊珊等，2010）。而质谱多肽序列分析的快速发展，也使蛋白质的鉴定更具规模化（Glinski and Wechwerth, 2006）。近年来，蛋白质组学研究已在多种作物的抗逆性研究中开展应用（Li et al., 2007; Mukherjee et al., 2009; Zhou et al., 2011；Zhang et al., 2013）。
萝卜是我国非常重要的十字花科根菜类作物，营养价值丰富。近年来，萝卜霜霉病（Peronospora parasitica）发生逐渐严重，加上病毒病的复合侵染，造成萝卜产量和品质严重下降。蛋白质组学是后基因组时代的新兴研究领域，它有助于人们从分子水平上了解植物耐受胁迫的机制。
蛋白质是植物性状和生命活动的控制者和执行者。植物在遭受胁迫时，会诱导一些基因的差异表达，从而影响蛋白质的表达情况。蛋白质组学方法可以高效地分离并鉴定出胁迫响应蛋白。Amey等（2008）提取豌豆叶片经霜霉菌侵染4天后的蛋白质，双向电泳分析发现有12个蛋白点显著增长，胞质及膜核酸相关蛋白被诱导产生。赵大伟等（2010）利用双向电泳技术提取黄瓜接种霜霉菌前后不同时期的蛋白，分析发现它们主要参与了能量代谢、光合作用、转录调节等生命活动。对变化的蛋白质进行定量和定性测定，获得蛋白质与抗性之间的关系，探讨植物逆境胁迫条件下生理过程、代谢、调控等方面的机制，是研究植物抗逆性的重要手段之一。因此，本实验利用双向电泳技术分离出侵染霜霉菌前后差异表达的蛋白点，并进一步通过质谱鉴定对其进行功能分类，结合转录水平的变化，以期为阐述萝卜抗病机理提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以大学作物遗传与种质创新国家重点实验室萝卜课题组提供的易感霜霉病品种“NAUBJQ”为供试材料。培养皿内催芽，穴盘育苗，常规管理。
1.2 病原菌的制备与接种处理
将采回的病叶表面着生的霉层及其附着物用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗，放置在黑暗条件下20℃保湿（RH=95%，将病叶放在培养皿中，叶片上下铺上湿润的吸水纸或滤纸）24h，用湿棉球将新产生的孢子囊轻轻剥落于蒸馏水中制成悬浮液，通过显微镜观察其孢子的形态，并用血球计数板计算孢子浓度，最后稀释至1×105个孢子/ml（也可在100倍显微镜下观察，其浓度为每视野平均孢子囊数50～100个），最后加入标定体积的0.1% 的吐温20，即制备成接种液。在植株4叶期采用喷雾法接种，接种量为150200μl/株，对照组接种同量的ddH2O，接种后黑暗保湿24h后（可用黑色PE袋罩住），转移至自然条件下管理（高相敏，2009）。接种7d后取对照组及处理组的植株叶片各4g（重复3次），液氮速冻后进行总蛋白质的提取。
1.3 蛋白质的提取
采用TrisHcl/TCA丙酮法进行总蛋白的提取：将叶片放入研钵中，加液氮研磨成粉末，期间加入样品量10%的PVPP和4 ml TrisHCl提取液（100mM TrisHCl pH7.5，100mM KCl，50mM EDTA，2mM DTT），4℃静置1h；然后12000rpm，4℃离心15min，取上清，加入40 ml预冷的10% TCA/丙酮，20℃下沉淀过夜；12000rpm，4℃下离心15min，弃上清，用预冷的10% TCA/丙酮洗涤沉淀；重复上步3次，最后真空冷冻干燥，80℃保存备用。
1.4 蛋白质的溶解
以1mg:30μL的比例将干燥的蛋白粉末加入到蛋白质裂解液（2M硫脲，7M尿素，60mM DTT，4% CHAPS和0.8% Pharmalyte pH 310）中，充分浸泡，涡旋，必要时超声波助溶。12000rpm，15℃ 离心20min，所得上清液即为蛋白质溶液，立即进行双向电泳或者分装后70℃保存。按照Bradford（1976）法测定蛋白质浓度。
1.5 双向电泳
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料 2
1.2 病原菌的制备与接种处理 2
1.3 蛋白质的提取2
1.4 蛋白质的溶解2
1.5 双向电泳2
1.5.1 等电聚焦2
1.5.2 胶条的平衡3
1.5.3 SDSPAGE3
1.6 考马斯亮蓝染色 3
1.7 图像采集与分析3
1.8质谱分析与数据库检索3
1.9 编码差异蛋白基因的表达特征分析3
1.9.1 总RNA提取3
1.9.2 RNA纯化3
1.9.3 RNA检测4
1.9.4 RNA反转录4
1.9.5 引物设计与合成4
2 结果与分析5
2.1萝卜感染霜霉菌前后蛋白质双向电泳图谱分析5
2.2 差异蛋白点的质谱鉴定 7
2.3 差异调节蛋白质（多肽）的功能分类 8
2.4 编码差异蛋白基因的表达特征分析8
2.
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
4.1 RNA 提取检测8
2.4.2 差异基因表达分析9
3讨论9
3.1 蛋白质合成、代谢和稳定蛋白9
3.2 糖类和能量代谢相关蛋白 10
3.3 光合作用相关蛋白 10
3.4 抗性相关蛋白 11
3.5 调控蛋白 11
3.6 信号转导相关蛋白 11
致谢12
参考文献12
图1 叶片感染霜霉菌前后蛋白质双向电泳图谱6
图2 霜霉菌处理前后不同时期RNA电泳图8图3差异蛋白的基因表达分析9
表1 目的基因片段的引物设计5
表2 蛋白质 MALDITOFMS 分析结果7
萝卜霜霉病抗性相关蛋白质组学研究
引言
蛋白质组（Proteome）的概念是蛋白质（Protein）、基因组（Genome）两个词的融合，指基因组中所表达的全部蛋白质。蛋白质组学（Proteomics）是从整体水平上分析研究组织、细胞内变化的蛋白的成分、表达水平与修饰状态，进而了解细胞的各项功能、生理生化过程及对胁迫的反应过程，是揭示蛋白质功能与细胞生命活动的一个新兴领域（刘珊珊等，2010）。而质谱多肽序列分析的快速发展，也使蛋白质的鉴定更具规模化（Glinski and Wechwerth, 2006）。近年来，蛋白质组学研究已在多种作物的抗逆性研究中开展应用（Li et al., 2007; Mukherjee et al., 2009; Zhou et al., 2011；Zhang et al., 2013）。
萝卜是我国非常重要的十字花科根菜类作物，营养价值丰富。近年来，萝卜霜霉病（Peronospora parasitica）发生逐渐严重，加上病毒病的复合侵染，造成萝卜产量和品质严重下降。蛋白质组学是后基因组时代的新兴研究领域，它有助于人们从分子水平上了解植物耐受胁迫的机制。
蛋白质是植物性状和生命活动的控制者和执行者。植物在遭受胁迫时，会诱导一些基因的差异表达，从而影响蛋白质的表达情况。蛋白质组学方法可以高效地分离并鉴定出胁迫响应蛋白。Amey等（2008）提取豌豆叶片经霜霉菌侵染4天后的蛋白质，双向电泳分析发现有12个蛋白点显著增长，胞质及膜核酸相关蛋白被诱导产生。赵大伟等（2010）利用双向电泳技术提取黄瓜接种霜霉菌前后不同时期的蛋白，分析发现它们主要参与了能量代谢、光合作用、转录调节等生命活动。对变化的蛋白质进行定量和定性测定，获得蛋白质与抗性之间的关系，探讨植物逆境胁迫条件下生理过程、代谢、调控等方面的机制，是研究植物抗逆性的重要手段之一。因此，本实验利用双向电泳技术分离出侵染霜霉菌前后差异表达的蛋白点，并进一步通过质谱鉴定对其进行功能分类，结合转录水平的变化，以期为阐述萝卜抗病机理提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以大学作物遗传与种质创新国家重点实验室萝卜课题组提供的易感霜霉病品种“NAUBJQ”为供试材料。培养皿内催芽，穴盘育苗，常规管理。
1.2 病原菌的制备与接种处理
将采回的病叶表面着生的霉层及其附着物用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗，放置在黑暗条件下20℃保湿（RH=95%，将病叶放在培养皿中，叶片上下铺上湿润的吸水纸或滤纸）24h，用湿棉球将新产生的孢子囊轻轻剥落于蒸馏水中制成悬浮液，通过显微镜观察其孢子的形态，并用血球计数板计算孢子浓度，最后稀释至1×105个孢子/ml（也可在100倍显微镜下观察，其浓度为每视野平均孢子囊数50～100个），最后加入标定体积的0.1% 的吐温20，即制备成接种液。在植株4叶期采用喷雾法接种，接种量为150200μl/株，对照组接种同量的ddH2O，接种后黑暗保湿24h后（可用黑色PE袋罩住），转移至自然条件下管理（高相敏，2009）。接种7d后取对照组及处理组的植株叶片各4g（重复3次），液氮速冻后进行总蛋白质的提取。
1.3 蛋白质的提取
采用TrisHcl/TCA丙酮法进行总蛋白的提取：将叶片放入研钵中，加液氮研磨成粉末，期间加入样品量10%的PVPP和4 ml TrisHCl提取液（100mM TrisHCl pH7.5，100mM KCl，50mM EDTA，2mM DTT），4℃静置1h；然后12000rpm，4℃离心15min，取上清，加入40 ml预冷的10% TCA/丙酮，20℃下沉淀过夜；12000rpm，4℃下离心15min，弃上清，用预冷的10% TCA/丙酮洗涤沉淀；重复上步3次，最后真空冷冻干燥，80℃保存备用。
1.4 蛋白质的溶解
以1mg:30μL的比例将干燥的蛋白粉末加入到蛋白质裂解液（2M硫脲，7M尿素，60mM DTT，4% CHAPS和0.8% Pharmalyte pH 310）中，充分浸泡，涡旋，必要时超声波助溶。12000rpm，15℃ 离心20min，所得上清液即为蛋白质溶液，立即进行双向电泳或者分装后70℃保存。按照Bradford（1976）法测定蛋白质浓度。
1.5 双向电泳
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