抗建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒rdrp基因
本研究根据Genbank中建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒复制酶RdRp基因的保守序列设计引物，以蝴蝶兰生产温室中两种病毒的分离物为模版，成功扩增了两种病毒的RdRp基因片段，与数据库中病毒序列同源性均在98%以上，并利用融合PCR将两种病毒片段串联在一起，然后通过Gateway技术的BP反应和LR反应将融合产物插入到基因沉默表达载体pHellsgate12中，成功构建了可同时抗建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的发夹结构RNA干扰载体，为兰花多抗基因工程育种奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 植物材料 2
1.1.2 载体和试剂 2
1.2 方法 2
1.2.1 引物设计、扩增及融合PCR2
1.2.2 attBPCR产物的纯化3
1.2.3 利用BP重组反应创建入门克隆3
1.2.4 利用 LR重组反应创建表达克隆3
1.2.5 转化农杆菌3
2 结果3
2.1 建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp基因的克隆和PCR融合3
2.2 入门克隆的检测4
2.3 表达载体的构建4
2.4 农杆菌检测4
3 讨论 5
致谢6
参考文献6
抗建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp基因
hpRNAi表达载体的构建
引言
引言 目前，世界上已报导的兰花病毒有：建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒、建兰轻性花叶病毒、建兰环斑病毒、番茄环斑病毒、万代兰花叶病毒、石斛兰花叶病毒、洋兰斑点病毒和黄瓜花叶病毒等10来种病毒，其中以建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus, CymMV)和齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus, ORSV）发生最为普遍。CyMV为迄今从兰花上分离到的约25种病毒中分布最广、危害最严重者之一的，传播途径主要有汁液, 桃蚜和接触。建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒是侵 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
染蝴蝶兰的两种主要病毒病原。这2种病毒能侵染兰科及其他科共20多种植物[1]，能使兰花叶片形成不规则的褪绿条纹、圆斑、环斑甚至坏死，在花瓣上表现放射状褪色条纹，并且时常复合感染，危害加剧，使兰花观赏价值和经济价值大为下降[2～5]。
目前生产上还不能通过化学药剂防治兰花病毒，过去主要通过茎尖培养脱毒的方法，但存在脱毒率低、费事费力，生产中管理不善，病毒宜重新感染等缺点。随着植物基因工程的发展，在兰科植物中利用病毒外壳蛋白介导的抗病毒的研究也有报道，2004年,台湾Li等[6]和Chan等[7](2005)将CymMV病毒的CP 基因转入蝴蝶兰中，得到了具有抗病性的蝴蝶兰植株，但由于不同地区兰花病毒株存在差异，导致了转基因植株大范围推广时抗病能力会减弱甚至抗性丧失，同时病毒基因会种植株中表达，会引起公众对转基因安全的忧虑，限制了其在生产上的应用。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是最近几年发展起来的一门新兴的在转录水平上的基因阻断技术，将病毒的某一序列设计成双链结构导进植物体使之表达，可诱发RNA沉默强化植物体内自然的RNA沉默抗病毒能力，这使得高抗病毒性的转基因植物的获得成为可能。研究证明，利用hpRNA沉默策略不仅可以获得较高抗性的转基因植株，而且由于不表达病毒蛋白，能减少人们对携带病毒基因的转基因作物安全性的顾虑，使种质创新目的性更强也更加安全有效；在高保守区段设计靶序列，并且只需20bp的同源序列就能引起病毒沉默，能避免病毒因非保守区的高突变率而产生的耐抗性突变株；同时还可以将多个基因序列串联起来而获得对多个病毒的广谱抗性[8]。
本实验根据Genbank中建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒病毒复制酶基因的保守序列设计引物，利用融合PCR技术和Gateway技术快速构建可同时抗建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的RNA干扰载体，为通过基因工程技术选育多抗的兰花新品种奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料和试剂
1．1．1 植物材料 从镇江超群蝴蝶兰生产温室蝴蝶兰样品获得建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒分离物，经RTPCR检测，保存于本氏烟(Nicotiana benthamiana)中。
1．1．2 载体和试剂 入门载体pDONRTM221、BP clonase TMⅡ和LR clonase TMⅡ购自美国Invitrogen公司，表达载体pHellsgate12 (GenBankCS591107) 由CSIRO Plant Industry 提供，质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒和PCR反应试剂购于大连TaKaRa 生物有限公司，大肠杆菌DH5α菌株由本实验室保存。
1．2 方法
1．2．1 引物设计、扩增及融合PCR 分别根据NCBI数据库中建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒病毒复制酶RdRp设计引物（表1），扩增长度为287bp和387bp，CyMV的上游引物CYRPGWF和ORSV的下游引物ORRPGWR侧翼含有Gateway attB位点（划线部分），CyMV的下游引物CYRPR和ORSV的上游引物ORRPF含有21bp的重叠区域（阴影部分），以便利用Gateway系统插入载体和融合PCR把两个病毒片段进行连接。
利用上述两对引物，分别以含有建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的cDNA为模板，进行PCR扩增反应，扩增采用50μL体系：模板2.5μL，引物各2.5μL（10 μmolL1），dNTP Mixture 4.0μL（各2.5 mmolL1），10×PCR Buffer(Mg2 + plus) 5.0 μ L，TaqE 0.5μL, 33 μL 灭菌超纯水补齐。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；（94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min）35 个循环；72 ℃后延伸10 min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，用回收纯化试剂盒进行纯化去除引物及引物二聚体，回收目标条带。
利用融合PCR技术连接两个RdRp序列，在引物CYRPGWF 和ORRPGWR作用下，以回收后的产物为模板，进行PCR融合。融合采用50μL体系：模板各2.5μL，引物各2.5μL（10 μmoL1），dNTP Mixture 4.0μL（各2.5 mmolL1），10×PCR Buffer(Mg2 + plus) 5.0 μ L，TaqE 0.5μL, 30.5 μL 灭菌超纯水补齐。融合条件同以上PCR扩增程序（图1）。
表1 PCR扩增所用引物序列
Table 1 Primers for fragments amplification
引物名称 引物序列
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 植物材料 2
1.1.2 载体和试剂 2
1.2 方法 2
1.2.1 引物设计、扩增及融合PCR2
1.2.2 attBPCR产物的纯化3
1.2.3 利用BP重组反应创建入门克隆3
1.2.4 利用 LR重组反应创建表达克隆3
1.2.5 转化农杆菌3
2 结果3
2.1 建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp基因的克隆和PCR融合3
2.2 入门克隆的检测4
2.3 表达载体的构建4
2.4 农杆菌检测4
3 讨论 5
致谢6
参考文献6
抗建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RdRp基因
hpRNAi表达载体的构建
引言
引言 目前，世界上已报导的兰花病毒有：建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒、建兰轻性花叶病毒、建兰环斑病毒、番茄环斑病毒、万代兰花叶病毒、石斛兰花叶病毒、洋兰斑点病毒和黄瓜花叶病毒等10来种病毒，其中以建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus, CymMV)和齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus, ORSV）发生最为普遍。CyMV为迄今从兰花上分离到的约25种病毒中分布最广、危害最严重者之一的，传播途径主要有汁液, 桃蚜和接触。建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒是侵 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
染蝴蝶兰的两种主要病毒病原。这2种病毒能侵染兰科及其他科共20多种植物[1]，能使兰花叶片形成不规则的褪绿条纹、圆斑、环斑甚至坏死，在花瓣上表现放射状褪色条纹，并且时常复合感染，危害加剧，使兰花观赏价值和经济价值大为下降[2～5]。
目前生产上还不能通过化学药剂防治兰花病毒，过去主要通过茎尖培养脱毒的方法，但存在脱毒率低、费事费力，生产中管理不善，病毒宜重新感染等缺点。随着植物基因工程的发展，在兰科植物中利用病毒外壳蛋白介导的抗病毒的研究也有报道，2004年,台湾Li等[6]和Chan等[7](2005)将CymMV病毒的CP 基因转入蝴蝶兰中，得到了具有抗病性的蝴蝶兰植株，但由于不同地区兰花病毒株存在差异，导致了转基因植株大范围推广时抗病能力会减弱甚至抗性丧失，同时病毒基因会种植株中表达，会引起公众对转基因安全的忧虑，限制了其在生产上的应用。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是最近几年发展起来的一门新兴的在转录水平上的基因阻断技术，将病毒的某一序列设计成双链结构导进植物体使之表达，可诱发RNA沉默强化植物体内自然的RNA沉默抗病毒能力，这使得高抗病毒性的转基因植物的获得成为可能。研究证明，利用hpRNA沉默策略不仅可以获得较高抗性的转基因植株，而且由于不表达病毒蛋白，能减少人们对携带病毒基因的转基因作物安全性的顾虑，使种质创新目的性更强也更加安全有效；在高保守区段设计靶序列，并且只需20bp的同源序列就能引起病毒沉默，能避免病毒因非保守区的高突变率而产生的耐抗性突变株；同时还可以将多个基因序列串联起来而获得对多个病毒的广谱抗性[8]。
本实验根据Genbank中建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒病毒复制酶基因的保守序列设计引物，利用融合PCR技术和Gateway技术快速构建可同时抗建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的RNA干扰载体，为通过基因工程技术选育多抗的兰花新品种奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料和试剂
1．1．1 植物材料 从镇江超群蝴蝶兰生产温室蝴蝶兰样品获得建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒分离物，经RTPCR检测，保存于本氏烟(Nicotiana benthamiana)中。
1．1．2 载体和试剂 入门载体pDONRTM221、BP clonase TMⅡ和LR clonase TMⅡ购自美国Invitrogen公司，表达载体pHellsgate12 (GenBankCS591107) 由CSIRO Plant Industry 提供，质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒和PCR反应试剂购于大连TaKaRa 生物有限公司，大肠杆菌DH5α菌株由本实验室保存。
1．2 方法
1．2．1 引物设计、扩增及融合PCR 分别根据NCBI数据库中建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒病毒复制酶RdRp设计引物（表1），扩增长度为287bp和387bp，CyMV的上游引物CYRPGWF和ORSV的下游引物ORRPGWR侧翼含有Gateway attB位点（划线部分），CyMV的下游引物CYRPR和ORSV的上游引物ORRPF含有21bp的重叠区域（阴影部分），以便利用Gateway系统插入载体和融合PCR把两个病毒片段进行连接。
利用上述两对引物，分别以含有建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的cDNA为模板，进行PCR扩增反应，扩增采用50μL体系：模板2.5μL，引物各2.5μL（10 μmolL1），dNTP Mixture 4.0μL（各2.5 mmolL1），10×PCR Buffer(Mg2 + plus) 5.0 μ L，TaqE 0.5μL, 33 μL 灭菌超纯水补齐。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；（94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min）35 个循环；72 ℃后延伸10 min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，用回收纯化试剂盒进行纯化去除引物及引物二聚体，回收目标条带。
利用融合PCR技术连接两个RdRp序列，在引物CYRPGWF 和ORRPGWR作用下，以回收后的产物为模板，进行PCR融合。融合采用50μL体系：模板各2.5μL，引物各2.5μL（10 μmoL1），dNTP Mixture 4.0μL（各2.5 mmolL1），10×PCR Buffer(Mg2 + plus) 5.0 μ L，TaqE 0.5μL, 30.5 μL 灭菌超纯水补齐。融合条件同以上PCR扩增程序（图1）。
表1 PCR扩增所用引物序列
Table 1 Primers for fragments amplification
引物名称 引物序列
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