萝卜基因组snp标记的开发与应用
摘要：本研究选取康奈尔大学公布的含SNP位点的Unigene库的前500条EST-SNP序列，逐一下载其序列比对结果，共得到1536个SNP位点。通过Blast2GO软件对Unigene进行GO功能注释。同时利用dCAPS Finder 2.0对EST-SNP序列在SNP位点处的限制性内切酶酶切位点进行分析，选取那些常用酶在SNP位点能区分野生型及突变型的序列，进行引物设计，之后用SNP程序扩增萝卜基因组DNA，并由其相应的限制性内切酶进行酶切反应，将SNP转变为CAPS标记。测试的5对CAPS引物都能在品种不同的萝卜材料中进行有效扩增，并有3对引物酶切产物表现出多态性，CAPS标记转化成功率为60%。结果表明将萝卜基因组SNP转化为CAPS标记的方法具有高效率、低成本的优点，有利于萝卜的遗传育种研究。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Keywords 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.2 方法 3
1.2.1 植物材料DNA提取 3
1.2.2 萝卜ESTSNP序列的获得及功能分析 3
1.2.4 PCR反应及酶切反应 3
2 结果与分析 3
2.1 萝卜基因组DNA的提取 4
2.2 ESTSNP突变位点的获得及SNP在EST序列中的特征 4
2.3 ESTSNP序列功能分析 4
2.4 ESTSNP序列在SNP位点处的酶切分析 5
2.5 基于ESTSNP序列的CAPS标记的开发 6
3 讨论 7
3.1 ESTSNP标记的挖掘 7
3.2 CAPS标记的转化 7
3.3 CAPS标记与相关性状的结合 8
致谢 8
参考文献： 8
萝卜基因组SNP标记的开发与应用
引言
引言
DNA分子标记技术是基因定位克隆、遗传图谱构建等研究工作的重要工具，已广泛应用于作物分子辅助育种及种质资源多样性分析等领域 (Chao S et al.,20
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
08)。目前应用的遗传标记有AFLP, SSR, RAPD, RFLP, ISSR等（龚义勤 等，2006）。但这些分子标记技术自身具有通量小、精确性低、所需人力和时间成本高、在基因组上不能广泛分布等局限性，限制了其进一步的发展与应用（肖炳光 等，2014）。
SNP (single nucleotide polymorphism)—单核苷酸多态性，是指基因组范围内单个碱基的插入、缺失、转换、颠换或小片段的突变等（束永俊 等，2010）。SNP具有变异来源丰富、潜在数量巨大等优点，生物个体中SNP数量比其他类型分子标记更为丰富、更具有多态性（刘峰 等，2014），如玉米基因组中SNP频率为每100 bp就出现一个SNP (Tenaillon M I et al.,2001)，水稻为89 bp (Nasu S et al.,2002)，葡萄为47 bp (Lijavetzky D et al.,2007)。SNP以如此高的频率在基因组上发生，不仅非常适合进行高通量分析，而且通过SNP分析，能够发现许多不能被其他标记所检测到的隐藏的多态性位点，能为研究者提供最丰富的DNA多态性资源。被认为是应用前景最好的遗传标记物（王丽鸳 等，2012）。此外，SNP技术对不同基因型之间的比较更加直接，更适用于复杂性状的遗传分析、引起群体差异基因的识别等方面的研究，对植物高密度遗传图谱的构建、新基因的克隆以及SNP标记辅助育种等具有十分重要的意义。酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS)，又称PCRRFLP，是一种将特异引物PCR与限制性内切酶消化结合而产生的一种分子标记检测技术，具有共显性、位点特异性、操作简单和成本低等特点，在拟南芥、水稻、小麦、水稗 (Lang Pan et al.,2014) 等植物的基因的分型、定位、图位克隆和分子鉴定等方面得到广泛应用 (Komori T et al.,2007)。
萝卜(Raphanus sativus L.) 是原产于我国的重要蔬菜作物，为十字花科萝卜属一、二年生草本植物。其栽培历史悠久，种质资源丰富，但可有效利用的标记数量非常有限，从深度和广度进一步开展萝卜基因组研究，需要开发新的DNA分子标记。萝卜的基因组测序尚未完成，但随着萝卜EST测序和基因组测序的进行，公共数据库中积累了大量的序列信息，可通过比对不同萝卜品种的基因组序列，发现大量的SNP位点，这为大规模开发利用萝卜SNP标记奠定了基础。
本研究拟对康奈尔大学公布的含SNP位点的Unigene库进行分析，采用48个萝卜自然群体品种作为材料，以EcoRI, BamHI、HindIII三种通用性强的限制性内切酶作为酶切工具，将萝卜ESTSNP转化为CAPS标记，为快速、低成本检测 SNP 标记提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为大学作物遗传与种质创新国家重点实验室萝卜遗传育种研究室保存的萝卜高代自交系‘NAUYH’和‘NAUDY13’及其他46种萝卜基因型材料（表1）。实验材料于2014年9月6日播种于安徽萧县试验基地。
表1 用于萝卜基因组SNP标记开发的48个萝卜基因型
Table 1 48 radish genotypes for radish genomic SNP markers’development
编号
No
品种
Cultivar
来源
Origin
皮色
Skin colora
根型
Root shapeb
编号
No
品种
Cultivar
来源
Origin
皮色
Skin colora
根型
Root shapeb
1
‘RG’
Nantong, China
WH
GL
25
Sharlokhov
AlmaAta, azakhstan
RD
GL
2
‘LLYB’
China
WH
GL
26
‘NJH’
Nanjing, China
RD
GL
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Keywords 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.2 方法 3
1.2.1 植物材料DNA提取 3
1.2.2 萝卜ESTSNP序列的获得及功能分析 3
1.2.4 PCR反应及酶切反应 3
2 结果与分析 3
2.1 萝卜基因组DNA的提取 4
2.2 ESTSNP突变位点的获得及SNP在EST序列中的特征 4
2.3 ESTSNP序列功能分析 4
2.4 ESTSNP序列在SNP位点处的酶切分析 5
2.5 基于ESTSNP序列的CAPS标记的开发 6
3 讨论 7
3.1 ESTSNP标记的挖掘 7
3.2 CAPS标记的转化 7
3.3 CAPS标记与相关性状的结合 8
致谢 8
参考文献： 8
萝卜基因组SNP标记的开发与应用
引言
引言
DNA分子标记技术是基因定位克隆、遗传图谱构建等研究工作的重要工具，已广泛应用于作物分子辅助育种及种质资源多样性分析等领域 (Chao S et al.,20
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
08)。目前应用的遗传标记有AFLP, SSR, RAPD, RFLP, ISSR等（龚义勤 等，2006）。但这些分子标记技术自身具有通量小、精确性低、所需人力和时间成本高、在基因组上不能广泛分布等局限性，限制了其进一步的发展与应用（肖炳光 等，2014）。
SNP (single nucleotide polymorphism)—单核苷酸多态性，是指基因组范围内单个碱基的插入、缺失、转换、颠换或小片段的突变等（束永俊 等，2010）。SNP具有变异来源丰富、潜在数量巨大等优点，生物个体中SNP数量比其他类型分子标记更为丰富、更具有多态性（刘峰 等，2014），如玉米基因组中SNP频率为每100 bp就出现一个SNP (Tenaillon M I et al.,2001)，水稻为89 bp (Nasu S et al.,2002)，葡萄为47 bp (Lijavetzky D et al.,2007)。SNP以如此高的频率在基因组上发生，不仅非常适合进行高通量分析，而且通过SNP分析，能够发现许多不能被其他标记所检测到的隐藏的多态性位点，能为研究者提供最丰富的DNA多态性资源。被认为是应用前景最好的遗传标记物（王丽鸳 等，2012）。此外，SNP技术对不同基因型之间的比较更加直接，更适用于复杂性状的遗传分析、引起群体差异基因的识别等方面的研究，对植物高密度遗传图谱的构建、新基因的克隆以及SNP标记辅助育种等具有十分重要的意义。酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS)，又称PCRRFLP，是一种将特异引物PCR与限制性内切酶消化结合而产生的一种分子标记检测技术，具有共显性、位点特异性、操作简单和成本低等特点，在拟南芥、水稻、小麦、水稗 (Lang Pan et al.,2014) 等植物的基因的分型、定位、图位克隆和分子鉴定等方面得到广泛应用 (Komori T et al.,2007)。
萝卜(Raphanus sativus L.) 是原产于我国的重要蔬菜作物，为十字花科萝卜属一、二年生草本植物。其栽培历史悠久，种质资源丰富，但可有效利用的标记数量非常有限，从深度和广度进一步开展萝卜基因组研究，需要开发新的DNA分子标记。萝卜的基因组测序尚未完成，但随着萝卜EST测序和基因组测序的进行，公共数据库中积累了大量的序列信息，可通过比对不同萝卜品种的基因组序列，发现大量的SNP位点，这为大规模开发利用萝卜SNP标记奠定了基础。
本研究拟对康奈尔大学公布的含SNP位点的Unigene库进行分析，采用48个萝卜自然群体品种作为材料，以EcoRI, BamHI、HindIII三种通用性强的限制性内切酶作为酶切工具，将萝卜ESTSNP转化为CAPS标记，为快速、低成本检测 SNP 标记提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为大学作物遗传与种质创新国家重点实验室萝卜遗传育种研究室保存的萝卜高代自交系‘NAUYH’和‘NAUDY13’及其他46种萝卜基因型材料（表1）。实验材料于2014年9月6日播种于安徽萧县试验基地。
表1 用于萝卜基因组SNP标记开发的48个萝卜基因型
Table 1 48 radish genotypes for radish genomic SNP markers’development
编号
No
品种
Cultivar
来源
Origin
皮色
Skin colora
根型
Root shapeb
编号
No
品种
Cultivar
来源
Origin
皮色
Skin colora
根型
Root shapeb
1
‘RG’
Nantong, China
WH
GL
25
Sharlokhov
AlmaAta, azakhstan
RD
GL
2
‘LLYB’
China
WH
GL
26
‘NJH’
Nanjing, China
RD
GL
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