甜味蛋白基因brazzein在森林草莓中的遗传转化研究
摘要：近几年,随着植物分子生物技术的发展,利用甜味蛋白高甜度的特点,将甜味蛋白基因导入农作物中来改良农作物的口感,已经取得较大进展。矮牵牛中的FBP7启动子在草莓中具有果实特异表达的特点。本试验的目的就是将FBP7启动子与甜味蛋白基因Brazzein融合构建表达载体，采取农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法转入森林草莓（Fragaria vesca）野生型Ruegen中,获得转化植株，筛选得到转Brazzein基因的森林草莓。通过本研究，我们摸索出了适合于Ruegen的农杆菌转化方法，并获得了阳性植株，在此基础上将鉴定果实品质等一些生理生化指标。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法4
1.1材料4
1.2方法5
1.2.1 载体构建5
1.2.2 引物设计6
1.2.3 目的基因的合成 6
1.2.4 目的基因片段的回收6
1.2.5 大肠杆菌质粒提取7
1.2.6 重组质粒转化农杆菌感受态细胞 7
1.2.7 侵染转化、组培8
1.2.8 GUS染色8
2 结果与分析8
2.1目的基因PCR扩増结果克隆及鉴定 8
2．2转化植株的获得8
2.3 GUS染色结果9
3 讨论10
3.1 甜味蛋白基因Brazzein的合成 10
3.2菌液浓度和侵染时间对侵染成功率的影响10
3.3 GUS染色对转化成功的判断10
致谢11
参考文献11
附录12
甜味蛋白基因Brazzein在森林草莓中的遗传转化研究
引言
引言: 草莓(Fragaria x ananassa Duch.)属于蔷薇科多年生草本植物,是世界广泛种植的经济浆果,其经济及营养价值均较高。国外学者研究发现，草莓中的有效成分，可抑制癌肿的生长。每百克草莓含维生素C 50100毫克，
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
比苹果、葡萄高10倍以上。并且长期以来，中国各地都有栽培草莓，栽培面积广，栽培量大。近几年,随着植物分子生物技术的发展,利用甜味蛋白高甜度的特点,将甜味蛋白基因导入农作物中来改良农作物的口感,并取得较大进展。到目前为止, 已经有很多种外源目的基因已经导入到草莓中,其中也有很多的改良品质的基因,导入进的外源基因很多是在草莓果实的甜味程度、贮存时间长短、生长促进、抑制方面起到了某些改善、促进作用。
甜性蛋白基因Brazzein是一种新发现的甜味剂,它的低热量,高甜度, 作为一种新型的甜味剂逐渐吸引着人们的视线，用它制成的食物同时也适合给糖尿病的患者食用。甜味蛋白基因改良作物将会为人们提供更多的可以放心使用的健康食品。
含甜味蛋白基因Brazzein的植物产于西非[1],所以一般利用人工合成的方法来获取目的基因片段。同时利用合适的技术手段来改变果实质量, 目的蛋白的生产,已经在分子生物技术中取得了很大的进步。例如在甜味蛋白的家族中,神秘果素[23]等甜味蛋白已经转入了草莓中,并且表达稳定。
在研究甜味蛋白基因Brazzein的过程中,人工合成Brazzein蛋白,其中L型的Brazzein蛋白有甜味,D型的Brazzein蛋白没有甜味，随着对甜味蛋白的认识不断加深,利用植物表达系统和大肠杆菌、农杆菌等微生物表达系统大规模生产甜味蛋白基因Brazzein逐渐成为可能。而且，糖尿病患者也能够食用根据甜味蛋白基因Brazzein转录翻译的甜味蛋白，这于对想吃草莓的糖尿病患者来说是一个很好的消息。
本试验中将构建果实特异启动子驱动的甜味蛋白基因Brazzein表达载体,并转化到森林草莓品种‘Ruegen’中,对于研究甜味蛋白基因Brazzein在高等的植物中的表达,提高果实甜性品质,逐渐改善草莓质量、口感等具有特殊的意义。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株及表达载体
转化所用大肠杆菌（Escherichia coli）感受态DH5a以及农杆菌菌株感受态由南京诺唯赞生物科技有限公司购得；35s2300克隆载体由实验室保存。
1．1．2 主要生化试剂
特定位点的限制核酸内切酶Sal I、Buffer购自TaKaRa公司； DNA连接酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司，质粒小量提取试剂盒、DNA回收试剂盒等购买于Axygen公司,高保真DNA聚合酶、合成链原料dNTPs等购自南京诺唯赞生物科技有限公司,DNA Marker购自南京寿德试验器材有限公司,实验引物经设计后交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
1．1．3 转化外植体准备
转化外植体为森林草莓品种‘Ruegen’的幼嫩叶片。
先从生长室取得若干森林草莓品种‘Ruegen’的果实，用镊子剥下种子，分开置于滤纸上，在通风、干燥阴凉处放置若干天，待种子干燥后收集于5毫升离心管，挑选150粒左右饱满的种子放于灭过菌的5毫升离心管中。在超净工作台上进行种子灭菌（灭菌前用酒精棉擦拭超净工作台、擦拭带手套的手，打开酒精灯）：在5毫升离心管中加入3毫升百分之七十五酒精，上下颠倒摇晃5分钟（计时器计时），完成后将百分之七十五酒精用移液枪吸出，置于废液缸中，吸取3毫升灭过菌的ddH2O于5毫升离心管中，洗去多余的酒精，以同样的方法再洗一次（以彻底洗去酒精以免对种子造成更大的伤害），完成后加3毫升次氯酸钠（次氯酸钠注意避光保存），以同样的手法用计时器计时7分钟，上下颠倒摇晃，完成后继续用ddH2O清洗67次以彻底洗尽残余的次氯酸钠。在最后一次清洗好之后，将种子倒于干净的灭过菌的滤纸上，用在酒精灯上灼烧过的，冷却的镊子在每一个玻璃瓶中（MS培养基配好后分装到玻璃瓶中）放置45颗种子，在瓶盖上写上日期、名字，先于暗处28℃培养9天，待发芽后，置于组培室的光下培养，一般培养40多天后取长势一致的幼嫩叶片，用作试验中菌液侵染的外植体。
1．1．4 培养基以及培养条件
MS培养基的配制：在实验室的4℃冰箱中已有配好的各种母液（配方见附录）编号①⑥。配置时写有大量的为50毫升每升、微量的为5毫升每升（配置前洗净玻璃棒、大烧杯、锥形瓶若干），一般先取600毫升ddH2O,欧姆值在18附近为最佳，加入所需母液后，固体MS培养基加30克蔗糖，液体MS加15克蔗糖，蔗糖溶解后定容至1升，然后用盐酸或氢氧化钠将PH值调到5.805.85之间，固体培养基在分装之前加入1.85克每250毫升的琼脂粉，分装完成后，用封口膜、橡皮筋封住锥形瓶，写上名字、名称、日期后，进行高压蒸汽灭菌，设定值为121℃，20分钟。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法4
1.1材料4
1.2方法5
1.2.1 载体构建5
1.2.2 引物设计6
1.2.3 目的基因的合成 6
1.2.4 目的基因片段的回收6
1.2.5 大肠杆菌质粒提取7
1.2.6 重组质粒转化农杆菌感受态细胞 7
1.2.7 侵染转化、组培8
1.2.8 GUS染色8
2 结果与分析8
2.1目的基因PCR扩増结果克隆及鉴定 8
2．2转化植株的获得8
2.3 GUS染色结果9
3 讨论10
3.1 甜味蛋白基因Brazzein的合成 10
3.2菌液浓度和侵染时间对侵染成功率的影响10
3.3 GUS染色对转化成功的判断10
致谢11
参考文献11
附录12
甜味蛋白基因Brazzein在森林草莓中的遗传转化研究
引言
引言: 草莓(Fragaria x ananassa Duch.)属于蔷薇科多年生草本植物,是世界广泛种植的经济浆果,其经济及营养价值均较高。国外学者研究发现，草莓中的有效成分，可抑制癌肿的生长。每百克草莓含维生素C 50100毫克，
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
比苹果、葡萄高10倍以上。并且长期以来，中国各地都有栽培草莓，栽培面积广，栽培量大。近几年,随着植物分子生物技术的发展,利用甜味蛋白高甜度的特点,将甜味蛋白基因导入农作物中来改良农作物的口感,并取得较大进展。到目前为止, 已经有很多种外源目的基因已经导入到草莓中,其中也有很多的改良品质的基因,导入进的外源基因很多是在草莓果实的甜味程度、贮存时间长短、生长促进、抑制方面起到了某些改善、促进作用。
甜性蛋白基因Brazzein是一种新发现的甜味剂,它的低热量,高甜度, 作为一种新型的甜味剂逐渐吸引着人们的视线，用它制成的食物同时也适合给糖尿病的患者食用。甜味蛋白基因改良作物将会为人们提供更多的可以放心使用的健康食品。
含甜味蛋白基因Brazzein的植物产于西非[1],所以一般利用人工合成的方法来获取目的基因片段。同时利用合适的技术手段来改变果实质量, 目的蛋白的生产,已经在分子生物技术中取得了很大的进步。例如在甜味蛋白的家族中,神秘果素[23]等甜味蛋白已经转入了草莓中,并且表达稳定。
在研究甜味蛋白基因Brazzein的过程中,人工合成Brazzein蛋白,其中L型的Brazzein蛋白有甜味,D型的Brazzein蛋白没有甜味，随着对甜味蛋白的认识不断加深,利用植物表达系统和大肠杆菌、农杆菌等微生物表达系统大规模生产甜味蛋白基因Brazzein逐渐成为可能。而且，糖尿病患者也能够食用根据甜味蛋白基因Brazzein转录翻译的甜味蛋白，这于对想吃草莓的糖尿病患者来说是一个很好的消息。
本试验中将构建果实特异启动子驱动的甜味蛋白基因Brazzein表达载体,并转化到森林草莓品种‘Ruegen’中,对于研究甜味蛋白基因Brazzein在高等的植物中的表达,提高果实甜性品质,逐渐改善草莓质量、口感等具有特殊的意义。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株及表达载体
转化所用大肠杆菌（Escherichia coli）感受态DH5a以及农杆菌菌株感受态由南京诺唯赞生物科技有限公司购得；35s2300克隆载体由实验室保存。
1．1．2 主要生化试剂
特定位点的限制核酸内切酶Sal I、Buffer购自TaKaRa公司； DNA连接酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司，质粒小量提取试剂盒、DNA回收试剂盒等购买于Axygen公司,高保真DNA聚合酶、合成链原料dNTPs等购自南京诺唯赞生物科技有限公司,DNA Marker购自南京寿德试验器材有限公司,实验引物经设计后交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
1．1．3 转化外植体准备
转化外植体为森林草莓品种‘Ruegen’的幼嫩叶片。
先从生长室取得若干森林草莓品种‘Ruegen’的果实，用镊子剥下种子，分开置于滤纸上，在通风、干燥阴凉处放置若干天，待种子干燥后收集于5毫升离心管，挑选150粒左右饱满的种子放于灭过菌的5毫升离心管中。在超净工作台上进行种子灭菌（灭菌前用酒精棉擦拭超净工作台、擦拭带手套的手，打开酒精灯）：在5毫升离心管中加入3毫升百分之七十五酒精，上下颠倒摇晃5分钟（计时器计时），完成后将百分之七十五酒精用移液枪吸出，置于废液缸中，吸取3毫升灭过菌的ddH2O于5毫升离心管中，洗去多余的酒精，以同样的方法再洗一次（以彻底洗去酒精以免对种子造成更大的伤害），完成后加3毫升次氯酸钠（次氯酸钠注意避光保存），以同样的手法用计时器计时7分钟，上下颠倒摇晃，完成后继续用ddH2O清洗67次以彻底洗尽残余的次氯酸钠。在最后一次清洗好之后，将种子倒于干净的灭过菌的滤纸上，用在酒精灯上灼烧过的，冷却的镊子在每一个玻璃瓶中（MS培养基配好后分装到玻璃瓶中）放置45颗种子，在瓶盖上写上日期、名字，先于暗处28℃培养9天，待发芽后，置于组培室的光下培养，一般培养40多天后取长势一致的幼嫩叶片，用作试验中菌液侵染的外植体。
1．1．4 培养基以及培养条件
MS培养基的配制：在实验室的4℃冰箱中已有配好的各种母液（配方见附录）编号①⑥。配置时写有大量的为50毫升每升、微量的为5毫升每升（配置前洗净玻璃棒、大烧杯、锥形瓶若干），一般先取600毫升ddH2O,欧姆值在18附近为最佳，加入所需母液后，固体MS培养基加30克蔗糖，液体MS加15克蔗糖，蔗糖溶解后定容至1升，然后用盐酸或氢氧化钠将PH值调到5.805.85之间，固体培养基在分装之前加入1.85克每250毫升的琼脂粉，分装完成后，用封口膜、橡皮筋封住锥形瓶，写上名字、名称、日期后，进行高压蒸汽灭菌，设定值为121℃，20分钟。
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