美国文图拉和六合黄心芹中celi基因
CELI酶是芹菜中分离出的单链特异性核酸酶，高效特异地识别双链DNA中碱基突变形成的错配和扭曲，能准确切割异源双链DNA中存在的错配位点。是TILLING技术中的关键酶。本实验以西芹美国‘文图拉’和本芹‘六合黄心芹’2个芹菜品种为实验材料，分别从中分离出核酸内切酶CELI基因序列并进行分析。结果表明，来源于 2种芹菜的CELI基因核苷酸序列高度保守，cDNA全长均为891 bp可阅读框，编码296个氨基酸。2种芹菜的CELI基因核苷酸序列之间有20个位点不同，但只有3个氨基酸位点不同。2种芹菜该酶蛋白分子量分别为33.92 kDa和33.88 kDa，pI值分别为6.37和6.51。进化分析结果显示，芹菜中的CELI与同属于伞形科的欧芹（Petroselinum crispum）进化关系最近，伞形科的CELI进化上更接近于菊科。实时定量PCR分析表明，芹菜中CELI基因在根、茎、叶、花等不同组织以及不同品种之间中的表达量有明显不同。对2种芹菜分别进行4℃、38℃、NaCl、PEG等处理，结果显示，4种处理条件下芹菜中CELI基因表达量有明显不同，PEG处理表达量呈现出明显减少。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1材料与方法 2
1.1 菌株、质粒与植物材料 2
1.2 芹菜核酸内切酶CELI基因的分离及序列分析 2
1.3 实时荧光定量PCR反应 3
2 结果与分析 3
2.1芹菜核酸内切酶CELI基因的分离 3
2.2芹菜核酸内切酶CELI的氨基酸序列分析 5
2.3 芹菜核酸内切酶CELI氨基酸序列的进化分析 6
2.4 芹菜CELI 基因在2个芹菜品种不同组织表达情况 6
2.5 芹菜CELI基因在不同逆境处理下表达情况 7
3 讨论 7
致谢8
参考文献8
美国文图拉和六合黄心芹中CELI基因的分离及相关研究
引言
引言
芹菜( Apium graveolens) 是伞形科( Umbellife *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
rae) 一年或多年生草本植物，在我国栽培历史悠久，分布较广。栽培芹菜主要分为本芹和西芹，在我国，本芹一般比西芹具有更大的环境适应性[1]。 本实验采用西芹美国‘文图拉’和本芹‘六合黄心芹’2个品种的芹菜作为实验材料。美国‘文图拉’为典型的西芹品种，具有产量高、抗性强、适应性广、商品性好等特点；‘六合黄心芹’是南京市六合地区优良的地方品种，具有产量高、香味浓、品质佳等特点，为典型的本芹品种[2,3]。相较于本芹，西芹植株更为紧凑粗大，叶柄宽厚，实心，质地较脆嫩，水分含量高。
CELI酶是第一个从芹菜中发现的核酸内切酶（endonuclease）, 该酶能够高效特异地识别双链DNA中碱基突变形成的错配和扭曲，能准确切割异源双链DNA中存在的错配位点[47]。在其它多种植物中，如绿豆芽(Vigna radiate）[8]、紫花苜蓿芽（Medicago sativa）[9]、豌豆（Pisum sativum）[10]、胡萝卜（Daucus carota）[11]、大麦（Hordeum vulgare） [12]、拟南芥（Arabidopsis thaliana） [13]等，陆续发现具有CELI酶类似功能的单链特异核酸内切酶。这一类型的酶广泛存在于不同蔬菜植物的根、茎、叶、花和果实中 [7,14]。CELI核酸内切酶可以识别多种不同类型的错配，对各种错配碱基切割偏爱程度表现为：C/C≥C/A~C/T≥G/G>A/C~A/A~T/C>T/G~G/T~G/A~A/G>T/T[14]。该酶能够从错配碱基的3端进行有效切割，同时也是TILLING技术中检测目的基因突变位点的关键酶[15]。
TILLING是一种全新的反向遗传学研究方法，在生物学突变体分析研究中以及作物品种改良方面有着巨大的潜力，已被应用于多种生物的研究中，如烟草（Nicotiana tabacum）[16]、玉米（Zea mays L）[17]、小麦（Triticum aestivum Linn.） [18,19]、大麦（Hordeum vulgare L.）[20]、大豆（Glycine max）[21,22]、水稻（Oryza sativa） [15]、果蝇（Drosophila[23]、斑马鱼（Danio rerio）[24]等。
本试验以西芹美国‘文图拉’和本芹‘六合黄心芹’为材料，分别对其全部基因序列进行分离，得到来源2种芹菜的核酸内切酶CELI基因，并对其进行生物信息学分析。利用实时定量PCR方法，进行2种芹菜不同组织特异性表达研究。通过低温（4 ℃）、高温（38 ℃）、盐胁迫（NaCl）、干旱胁迫（PEG）等胁迫处理2 h，测定2种芹菜中CELI基因，在非生物胁迫诱导下表达情况，以期为进一步研究CELI酶的功能奠定基础。
1 材料与方法
1．1 菌株、质粒与植物材料
本实验采用的大肠杆菌菌株为实验室保存的DH5α，连接所采用的质粒载体pMD18T vector、Ex Taq酶以及反转录酶Mlu I、dNTP荧光定量染料SYBR Green I和DL marker2000等均购自大连TaKaRa公司；DNA胶回收试剂盒采买自杭州爱思进公司。
2012年冬，于大学园艺学院江浦实验农场，分别挖取大田正常生长的‘六合黄心芹’和美国‘文图拉’植株，种植于大学园艺学院实验大棚过冬。于2013年春在一株成熟的植株上分别取芹菜的根、茎、叶、花等材料，进行各部位RNA的提取及cDNA的合成。
2013年3月，分别播种2种芹菜于大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室，在2个月龄时，分别进行4℃低温、38℃高温、20% PEG处理、0.2 mol.L1 以及NaCl处理2 h，分别提取叶片总RNA进行反转录成cDNA，用于实时定量PCR。
1．2 芹菜核酸内切酶CELI基因的分离及序列分析
实验材料的总RNA的提取参照RNA simple Total RNA Kit（Tiangen公司）试剂盒以及相关说明，并用1.2 %的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的总RNA的完整性。利用Prime Script RT reagent Kit（大连TaKaRa公司）将提取的总RNA反转录成cDNA。cDNA合成体系的总体积为20 μL。反应条件及过程为：总 RNA 和 50μmol L1Oligo（dT）18 混液于 70℃水浴 10 min；然后加入 MMLV 反转录酶（200 U）、dNTP（10mmol L1）、RNase 抑制剂（40 U）（TaKaRa 公司）及灭菌的双蒸水，置于 42℃水浴 60 min，最后于 70℃水浴变性 15 min。根据 GenBank 中旱芹（Apium graveolens Dulce Group）的CELI核酸内切酶基因（GenBank JX628904.1）序列设计一对引物 NXR39：5’ATGACGCGATTATATTCTGTGTTC3’ 和NXR40：5’TCATGCCAAAGAATGATCTG
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1材料与方法 2
1.1 菌株、质粒与植物材料 2
1.2 芹菜核酸内切酶CELI基因的分离及序列分析 2
1.3 实时荧光定量PCR反应 3
2 结果与分析 3
2.1芹菜核酸内切酶CELI基因的分离 3
2.2芹菜核酸内切酶CELI的氨基酸序列分析 5
2.3 芹菜核酸内切酶CELI氨基酸序列的进化分析 6
2.4 芹菜CELI 基因在2个芹菜品种不同组织表达情况 6
2.5 芹菜CELI基因在不同逆境处理下表达情况 7
3 讨论 7
致谢8
参考文献8
美国文图拉和六合黄心芹中CELI基因的分离及相关研究
引言
引言
芹菜( Apium graveolens) 是伞形科( Umbellife *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
rae) 一年或多年生草本植物，在我国栽培历史悠久，分布较广。栽培芹菜主要分为本芹和西芹，在我国，本芹一般比西芹具有更大的环境适应性[1]。 本实验采用西芹美国‘文图拉’和本芹‘六合黄心芹’2个品种的芹菜作为实验材料。美国‘文图拉’为典型的西芹品种，具有产量高、抗性强、适应性广、商品性好等特点；‘六合黄心芹’是南京市六合地区优良的地方品种，具有产量高、香味浓、品质佳等特点，为典型的本芹品种[2,3]。相较于本芹，西芹植株更为紧凑粗大，叶柄宽厚，实心，质地较脆嫩，水分含量高。
CELI酶是第一个从芹菜中发现的核酸内切酶（endonuclease）, 该酶能够高效特异地识别双链DNA中碱基突变形成的错配和扭曲，能准确切割异源双链DNA中存在的错配位点[47]。在其它多种植物中，如绿豆芽(Vigna radiate）[8]、紫花苜蓿芽（Medicago sativa）[9]、豌豆（Pisum sativum）[10]、胡萝卜（Daucus carota）[11]、大麦（Hordeum vulgare） [12]、拟南芥（Arabidopsis thaliana） [13]等，陆续发现具有CELI酶类似功能的单链特异核酸内切酶。这一类型的酶广泛存在于不同蔬菜植物的根、茎、叶、花和果实中 [7,14]。CELI核酸内切酶可以识别多种不同类型的错配，对各种错配碱基切割偏爱程度表现为：C/C≥C/A~C/T≥G/G>A/C~A/A~T/C>T/G~G/T~G/A~A/G>T/T[14]。该酶能够从错配碱基的3端进行有效切割，同时也是TILLING技术中检测目的基因突变位点的关键酶[15]。
TILLING是一种全新的反向遗传学研究方法，在生物学突变体分析研究中以及作物品种改良方面有着巨大的潜力，已被应用于多种生物的研究中，如烟草（Nicotiana tabacum）[16]、玉米（Zea mays L）[17]、小麦（Triticum aestivum Linn.） [18,19]、大麦（Hordeum vulgare L.）[20]、大豆（Glycine max）[21,22]、水稻（Oryza sativa） [15]、果蝇（Drosophila[23]、斑马鱼（Danio rerio）[24]等。
本试验以西芹美国‘文图拉’和本芹‘六合黄心芹’为材料，分别对其全部基因序列进行分离，得到来源2种芹菜的核酸内切酶CELI基因，并对其进行生物信息学分析。利用实时定量PCR方法，进行2种芹菜不同组织特异性表达研究。通过低温（4 ℃）、高温（38 ℃）、盐胁迫（NaCl）、干旱胁迫（PEG）等胁迫处理2 h，测定2种芹菜中CELI基因，在非生物胁迫诱导下表达情况，以期为进一步研究CELI酶的功能奠定基础。
1 材料与方法
1．1 菌株、质粒与植物材料
本实验采用的大肠杆菌菌株为实验室保存的DH5α，连接所采用的质粒载体pMD18T vector、Ex Taq酶以及反转录酶Mlu I、dNTP荧光定量染料SYBR Green I和DL marker2000等均购自大连TaKaRa公司；DNA胶回收试剂盒采买自杭州爱思进公司。
2012年冬，于大学园艺学院江浦实验农场，分别挖取大田正常生长的‘六合黄心芹’和美国‘文图拉’植株，种植于大学园艺学院实验大棚过冬。于2013年春在一株成熟的植株上分别取芹菜的根、茎、叶、花等材料，进行各部位RNA的提取及cDNA的合成。
2013年3月，分别播种2种芹菜于大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室，在2个月龄时，分别进行4℃低温、38℃高温、20% PEG处理、0.2 mol.L1 以及NaCl处理2 h，分别提取叶片总RNA进行反转录成cDNA，用于实时定量PCR。
1．2 芹菜核酸内切酶CELI基因的分离及序列分析
实验材料的总RNA的提取参照RNA simple Total RNA Kit（Tiangen公司）试剂盒以及相关说明，并用1.2 %的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的总RNA的完整性。利用Prime Script RT reagent Kit（大连TaKaRa公司）将提取的总RNA反转录成cDNA。cDNA合成体系的总体积为20 μL。反应条件及过程为：总 RNA 和 50μmol L1Oligo（dT）18 混液于 70℃水浴 10 min；然后加入 MMLV 反转录酶（200 U）、dNTP（10mmol L1）、RNase 抑制剂（40 U）（TaKaRa 公司）及灭菌的双蒸水，置于 42℃水浴 60 min，最后于 70℃水浴变性 15 min。根据 GenBank 中旱芹（Apium graveolens Dulce Group）的CELI核酸内切酶基因（GenBank JX628904.1）序列设计一对引物 NXR39：5’ATGACGCGATTATATTCTGTGTTC3’ 和NXR40：5’TCATGCCAAAGAATGATCTG
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/yy/400.html
