水稻香米调控基因badh2的crisprcas9敲除载体的构建
水稻中稻米香味是重要的食味品质。研究表明，稻米中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）的积累受到位于第8染色体的Badh2基因调控。本研究以不含香味物质的日本晴为背景材料，基于该材料的Badh2基因序列，设计基因敲除靶位点，构建了用于该基因敲除的CRISPR/Cas9载体。实验方案是从NCBI官网搜索并获得了Badh2基因的生物学信息并进行分析，通过gRNA表达盒制备、扩增gRNA表达盒、gRNA表达盒连接CRISPR/Cas9-MH载体、转化大肠杆菌DH5α及菌液PCR验证和载体测序结果分析的实验方法，结果表明了水稻Badh2基因的CRISPR基因敲除载体构建成功。为载体转化水稻品种，创制综合性状更好、品质更优的水稻材料奠定基础。关键词 水稻，香米，Badh2，CRISPR/Cas9，敲除载体
目 录
1 引言 1
1.1香稻 1
1.2 水稻香米调控基因Badh2研究情况 2
1.3 CRISPR/Cas9系统 2
1.4 本课题的目的和意义 4
2 材料与方法 4
2.1 实验材料 4
2.2 研究方法 5
3 结果与分析 9
3.1水稻香米调控基因Badh2的序列分析 9
3.2 Badh2基因的CRISPR/Cas9表达载体的构建和检测 12
结论 19
致谢 20
参考文献 21
1 引言
水稻是世界人口食用的主要粮食作物之一。随着人们生活水平的提高，对水稻的要求不仅仅局限于稻米的产量，稻米的品质和口感也成为了人们选择不同稻米的指标之一。作为栽培品种——香稻，因其稻米具有独特的香味深受广大消费者的喜爱和世界稻米市场的青睐[1]，同时也受到了重多研究者的重视。稻米的香味对消费者具有独特的吸引力，其销售价格比传统水稻销售价格高，例如泰国的茉莉香米的世界市场价值比非香米高两倍[2]。经检测，2乙酰基1吡咯啉（2AP）是最丰富的并且被认为是造成香味的原因[3]。基因编辑技术是近些年迅速发展的对目标基因组进行定向精准修饰的编辑技术，可以在基因组上的靶位点进行敲除、插入、替换碱基和点突变等进行定点人工修饰。主要包括人 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
工核酸酶介导的锌指核酸酶（ZFN）技术、类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）技术和 CRISPR/Cas 核酸酶（CRISPR/Cas RGNs）技术。目前备受瞩目的基因组定向编辑技术是CRISPR/Cas9技术，在《科学》杂志上评为2013年十大科学突破之一[4]。
1.1香稻
1.1.1香稻的定义及分类
根据中华人民共和国农业部行业标准(香稻NY/T596 2002 )，对香稻米的定义是：自身含有香味物质，其香味强度超过人对香味的识别阈，在蒸煮或生熟品尝过程中，能够逸出或散发令人敏感香味的稻米[5]。
香稻按植物学分类分为籼稻和粳稻两种类型；按谷粒颜色可分为黑香米、红香米和白香米三种类型；按香气可分为爆米花香、紫罗兰香、茉莉花香、山核桃香等香气类型；国际上由许多学者是按照水稻的谷粒长度将香稻分为短粒香稻和长粒香稻两种类型。
1.1.2 香稻的价值
香稻品种的种质资源丰富，遍及世界水稻生产国，如印度的Basmati品种群、美国的Oella品种群等[6]。香稻的营养价值高于非香稻，具有丰富的营养物质（如氨基酸、植物纤维、生物碱、维生素、脂肪酶、蛋白质和少量微量元素等），并且具有某种滋补和药用作用。香味是香稻最重要的品质之一[7]，也是水稻育种研究的重要内容。
1.1.3香味的影响因素及检测方法
香味性状不仅受遗传因素影响，还受气候条件、土壤条件、水质条件、以及
微量元素的影响。目前水稻香味的检测方法有嗅觉鉴定法法、咀嚼法(Dhulappanavar,1976)、热水法、氢氧化钾法、仪器测定法、香味指数法（日本佐竹利彦等，1988）[8]。
1.2 水稻香米调控基因Badh2研究情况
经前人克隆研究发现，香味基因的第 7个外显子出现 8 bp 的片段缺失和 3 bp 的碱基导致终止密码子提前出现，使翻译终止，改变了甜菜菜碱醛脱氢酶(Badh2)的蛋白质结构，造成2AP大量积累，因此水稻叶片和籽粒产生香味(Bradbury etal.,2005;Mawuenyega etal.,2005;Chen etal.,2006;2008)。而 Shi 等(2008)报道，Badh2 基因的第 2 外显子出现 7bp 的片段缺失致使稻米变香。这些研究结果的差异促进了人们对水稻香味的研究[9]。
随着研究的深入，研究人员普遍接受稻米香味的主要成分是2乙酰1吡咯啉，水稻香味遗传是受第八条染色体上的单个隐性基因Badh2 ( Betaine aldehyde dehydrogenase 2) 控制，该基因编码包含15个外显子和14个内含子，共有503 个氨基酸的甜菜碱醛脱氢酶。 当Badh2 在常规栽培的水稻中大量表达时，稻米则不具有香味； 当 Badh2发生突变后，水稻体内香味物质2乙酰1吡咯啉(2AP)大量积累，稻米则具有香味[10]。
1.3 CRISPR/Cas9系统
1.3.1 CRISPR/Cas9系统的相关概念
成簇规律间隔短回文重复（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，CRISPR）指生物体为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。其中II型CRISPR/Cas免疫系统的发现，使RNA介导的基因组编辑技术成为简单、方便、快速的功能基因组学研究工具。CRISPR是由间隔序列和高度保守的重复序列间隔排列组成。CRISPR/Cas9 是指古细菌和细菌在长期演化过程中所形成的一种适应性免疫防御系统，可以用来抵抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相应的 CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。
1.3.2 CRISPR/Cas9系统的组成及结构
CRISPR/Cas9系统基因组序列主要是由反式激活 CRISPR RNA（transactivating CRISPR RNA，tracr RNA） 序列区、Cas基因序列区和CRISPR
序列区三个部分组成[11]，见图1。tracr RNA主要是通过碱基配对与cr RNA结合形成tracrRNA/crRNA复合物，该复合物具有引导Cas9蛋白靶向目标序列的作用，从而发挥了核酸内切酶的靶向切割的功能。Cas9蛋白含有HNH结构域和 Ruv Clike结构域的两种核酸酶结构域。HNH结构域的功能：位置坐落于Cas9蛋白氨基端，切割点位于前间区序列邻近基序（protospacer adjacentmotif，PAM） 上游 3个核苷酸 （nucleotide，nt） 处，主要负责切割与cr RNA互补配对的DNA序列；Ruv Clike结构域的功能：位置坐落于蛋白中间位置，切割点位于PAM序列上游3～8 nt处，负责对DNA中的另一条链进行切割[12]。
目 录
1 引言 1
1.1香稻 1
1.2 水稻香米调控基因Badh2研究情况 2
1.3 CRISPR/Cas9系统 2
1.4 本课题的目的和意义 4
2 材料与方法 4
2.1 实验材料 4
2.2 研究方法 5
3 结果与分析 9
3.1水稻香米调控基因Badh2的序列分析 9
3.2 Badh2基因的CRISPR/Cas9表达载体的构建和检测 12
结论 19
致谢 20
参考文献 21
1 引言
水稻是世界人口食用的主要粮食作物之一。随着人们生活水平的提高，对水稻的要求不仅仅局限于稻米的产量，稻米的品质和口感也成为了人们选择不同稻米的指标之一。作为栽培品种——香稻，因其稻米具有独特的香味深受广大消费者的喜爱和世界稻米市场的青睐[1]，同时也受到了重多研究者的重视。稻米的香味对消费者具有独特的吸引力，其销售价格比传统水稻销售价格高，例如泰国的茉莉香米的世界市场价值比非香米高两倍[2]。经检测，2乙酰基1吡咯啉（2AP）是最丰富的并且被认为是造成香味的原因[3]。基因编辑技术是近些年迅速发展的对目标基因组进行定向精准修饰的编辑技术，可以在基因组上的靶位点进行敲除、插入、替换碱基和点突变等进行定点人工修饰。主要包括人 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
工核酸酶介导的锌指核酸酶（ZFN）技术、类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）技术和 CRISPR/Cas 核酸酶（CRISPR/Cas RGNs）技术。目前备受瞩目的基因组定向编辑技术是CRISPR/Cas9技术，在《科学》杂志上评为2013年十大科学突破之一[4]。
1.1香稻
1.1.1香稻的定义及分类
根据中华人民共和国农业部行业标准(香稻NY/T596 2002 )，对香稻米的定义是：自身含有香味物质，其香味强度超过人对香味的识别阈，在蒸煮或生熟品尝过程中，能够逸出或散发令人敏感香味的稻米[5]。
香稻按植物学分类分为籼稻和粳稻两种类型；按谷粒颜色可分为黑香米、红香米和白香米三种类型；按香气可分为爆米花香、紫罗兰香、茉莉花香、山核桃香等香气类型；国际上由许多学者是按照水稻的谷粒长度将香稻分为短粒香稻和长粒香稻两种类型。
1.1.2 香稻的价值
香稻品种的种质资源丰富，遍及世界水稻生产国，如印度的Basmati品种群、美国的Oella品种群等[6]。香稻的营养价值高于非香稻，具有丰富的营养物质（如氨基酸、植物纤维、生物碱、维生素、脂肪酶、蛋白质和少量微量元素等），并且具有某种滋补和药用作用。香味是香稻最重要的品质之一[7]，也是水稻育种研究的重要内容。
1.1.3香味的影响因素及检测方法
香味性状不仅受遗传因素影响，还受气候条件、土壤条件、水质条件、以及
微量元素的影响。目前水稻香味的检测方法有嗅觉鉴定法法、咀嚼法(Dhulappanavar,1976)、热水法、氢氧化钾法、仪器测定法、香味指数法（日本佐竹利彦等，1988）[8]。
1.2 水稻香米调控基因Badh2研究情况
经前人克隆研究发现，香味基因的第 7个外显子出现 8 bp 的片段缺失和 3 bp 的碱基导致终止密码子提前出现，使翻译终止，改变了甜菜菜碱醛脱氢酶(Badh2)的蛋白质结构，造成2AP大量积累，因此水稻叶片和籽粒产生香味(Bradbury etal.,2005;Mawuenyega etal.,2005;Chen etal.,2006;2008)。而 Shi 等(2008)报道，Badh2 基因的第 2 外显子出现 7bp 的片段缺失致使稻米变香。这些研究结果的差异促进了人们对水稻香味的研究[9]。
随着研究的深入，研究人员普遍接受稻米香味的主要成分是2乙酰1吡咯啉，水稻香味遗传是受第八条染色体上的单个隐性基因Badh2 ( Betaine aldehyde dehydrogenase 2) 控制，该基因编码包含15个外显子和14个内含子，共有503 个氨基酸的甜菜碱醛脱氢酶。 当Badh2 在常规栽培的水稻中大量表达时，稻米则不具有香味； 当 Badh2发生突变后，水稻体内香味物质2乙酰1吡咯啉(2AP)大量积累，稻米则具有香味[10]。
1.3 CRISPR/Cas9系统
1.3.1 CRISPR/Cas9系统的相关概念
成簇规律间隔短回文重复（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，CRISPR）指生物体为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。其中II型CRISPR/Cas免疫系统的发现，使RNA介导的基因组编辑技术成为简单、方便、快速的功能基因组学研究工具。CRISPR是由间隔序列和高度保守的重复序列间隔排列组成。CRISPR/Cas9 是指古细菌和细菌在长期演化过程中所形成的一种适应性免疫防御系统，可以用来抵抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相应的 CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。
1.3.2 CRISPR/Cas9系统的组成及结构
CRISPR/Cas9系统基因组序列主要是由反式激活 CRISPR RNA（transactivating CRISPR RNA，tracr RNA） 序列区、Cas基因序列区和CRISPR
序列区三个部分组成[11]，见图1。tracr RNA主要是通过碱基配对与cr RNA结合形成tracrRNA/crRNA复合物，该复合物具有引导Cas9蛋白靶向目标序列的作用，从而发挥了核酸内切酶的靶向切割的功能。Cas9蛋白含有HNH结构域和 Ruv Clike结构域的两种核酸酶结构域。HNH结构域的功能：位置坐落于Cas9蛋白氨基端，切割点位于前间区序列邻近基序（protospacer adjacentmotif，PAM） 上游 3个核苷酸 （nucleotide，nt） 处，主要负责切割与cr RNA互补配对的DNA序列；Ruv Clike结构域的功能：位置坐落于蛋白中间位置，切割点位于PAM序列上游3～8 nt处，负责对DNA中的另一条链进行切割[12]。
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