真空渗入法介导的不结球白菜激活标记突变体库的构建
激活标记技术是新近发展起来的一种用于基因分离与鉴定的方法。它通过诱使特定内源基因发生过量表达，而产生显性功能获得型突变，从而对基因进行鉴定和分析。在植物功能基因组学的研究中起着重要的作用。文章以不结球白菜为实验材料，以含有激活标记质粒pSKI015的农杆菌转化。以抗除草剂Basta为筛选标记，构建了不结球白菜的激活标记突变体库。结果共得到约42个独立转化株系（T1代），其中12个株系有明显的表型变化，约占转化植株总数的28.6% 。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1植物材料 2
1.2菌株与质粒 2
1.3“49菜心”的准备 2
1.4渗入转化液的准备2
1.5“49菜心”的转化3
1.5.1转化植株的管理3
1.5.2转化植株的筛选3
1.6反向PCR3
2 结果与分析4
2.1T1代转基因植株统计4
2.2T1代转基因植株的表型分析4
3讨论4
4研究结果的意义与展望5
致谢5
参考文献5
图 1激活标记载体pSKI015示意图2
图 2转化及筛选3
图 3普通植株和巨大化的突变株4
表1T1代转基因植株统计4
真空渗入法介导的不结球白菜激活标记突变体库的构建
引言
引言
现代生物技术的成功，极大的促进了生命科学的发展。在植物上运用这些技术，使人类可以更好的改良植物的性状，便于打破种属的界限，进行基因重组和转移。各种技术体系已经建立，并取得了巨大成就。
芸薹属（Brassica）是十字花科中的一个大属，包括100多个种，其中许多是重要的农作物，是油料、蔬菜的饲草的重要来源，某些作物含有重要保性物质［1］。很长一段时间，育种专家对不结球白菜等芸薹属作物很重视，使用所有可利用的方法，改良种质和种质资源创新，取得了丰硕的成果。植物基因工程技术的应用成为了解决农业方面 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
困难的新途径。
不结球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）是十字花科芸薹属芸薹种，简称白菜，又称青菜、小白菜，食用器官为叶柄和叶片，是一年生或二年生草本植物，其种类繁多，可周年栽培周年供应，长江及以南地区多有栽培。近年来，不结球白菜被东南亚和一些欧美国家广泛应用。不结球白菜的农艺性状决定其产量及商品性，而基因决定其农艺性状［2］。随着人口的增长，改良不结球白菜的品质，提高质量，是重中之重的任务。通过对基因功能的分析与鉴定，分析其有益基因用于育种，已经发展成为一种趋势。构建不结球白菜突变体库的意义可以帮助分析不结球白菜的基因功能，还可以扩大生物的多样性，获得新的性状和类型，同时为育种工作提供了新的种质资源。所以，对其功能基因组的研究刻不容缓。本文以不结球白菜为实验材料，通过真空渗入法来侵染植株，构建了不结球白菜的激活标记突变体库，其突变体库的构建可以帮助研究重要基因的一些功能。
那么如何将目的基因导入受体植株呢？目前，农杆菌介导的基因转化是主要方法，但是都要经过外植体组织培养阶段来获得转化再生植株。然而，组织培养不仅技术要求高、人财物话费较大，还容易产生体细胞变异、形态畸形、染色体数目改变和育性丧失等各种各样的问题导致遗传背景复杂化。转化后植株的筛选工作也比较困难。因此，植物原位转基因技术逐步发展起来。本实验将采用真空渗入技术。
1 材料与方法
1.1 植物材料
本实验所用的材料为“49菜心”种子。
1.2 菌株与质粒
农杆菌菌株为GV3101,已转入激活标记载体pSKI015，如图1。
图1激活标记载体pSKI015的示意图
Fig.1 Diagram of activation tagging vector pSKI015
1.3 “49菜心”的准备
将“49菜心”种子置于4 ℃冰箱中催芽，3 d后盆栽于温室中。15到30天后，取刚抽薹的植株为材料（图2A）。植株侵染前要将其从盆里取出，将根部的泥土用清水洗净，备用。
1.4 渗入转化液的准备
农杆菌菌株为GV3101（含质粒pSKI015），挑单菌落于YEP液体培养基中（组成为酵母提取物10 g/l，蛋白胨10 g/l，氯化钠5 g/l，pH 7.0）,28 ℃下震荡培养2 d，加抗生素利福平、卡那霉素和羧苄青霉素至终浓度各为50 mg/l。按1:50的比例在新鲜的含抗生素的YEP液体培养基中扩大培养至指数生长中期（菌液OD600≈1.5)［3］。2800×g离心10 min，弃上清。将沉淀重新悬浮于转化介质，制成渗入转化工程液。
1.5 “49菜心”的转化
将整个植株放入盛有渗入转化液的真空干燥器内，全部没入转化液中，进行真空处理，到达预定的设计时间后，关闭阀门，然后关闭真空抽气机，慢慢打开真空干燥器上的阀门，待恢复常压后，取出植株，立即定植于温室。处理好的植株呈现水渍状，通体墨绿色。对使用后的转化液，应当进行高压灭菌后丢弃；器具经过氧乙酸浸泡杀毒清洗后备用；操作场地应用70％酒精杀毒［1］，如图2B。
1.5.1 转化植株的管理
不结球白菜转化后马上定值于南农实验基地，定植时将下部受损伤严重的叶片摘掉，浇水灌透。维持棚内较高的湿度，以便利于缓苗，维持高湿度非常重要。温度保持在20℃—25℃ 7到10天后根据植株的恢复情况，逐渐放风，降低湿度，锻炼转化株。观察记录T0代植株的生长状况，收集杂交后代种子。种子成熟收获，干燥后保存。其他管理按照常规技术进行。
1.5.2 转化植株的筛选
从真空转化处理的植株(T0代)上收获的种子(T1代)，播种在平底苗盘中，每盘约播种50粒种子。播种的育苗基质为草炭3:蛭石1。出苗后，常规管理，待幼苗生长到子叶完全展开，喷施2.5 ml/L的商品除草剂Basta(phosphinotricin, Hoechst AG，FRG，含PPT 150mg/L)水溶液，来筛选抗性株。非抗性株在喷药后2—3天，叶片便开始枯萎，整个植株死掉，抗性株由于有Bar基因的表达产物，能够分解PPT而除去毒性，生长照常不受影响。 5—7天后第二次喷洒除草剂Basta，以防因为出苗晚或操作不当而存在的非筛选植株，再过5—7天后第三次喷洒除草剂Basta［1］。根据以往的经验，三次筛选，可以杜绝可能存在的遗漏筛选现象。期间根据苗的大小适时移植到大的盆钵中。最后剩下的植株视为抗性株。观察、记录T1代表型。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1植物材料 2
1.2菌株与质粒 2
1.3“49菜心”的准备 2
1.4渗入转化液的准备2
1.5“49菜心”的转化3
1.5.1转化植株的管理3
1.5.2转化植株的筛选3
1.6反向PCR3
2 结果与分析4
2.1T1代转基因植株统计4
2.2T1代转基因植株的表型分析4
3讨论4
4研究结果的意义与展望5
致谢5
参考文献5
图 1激活标记载体pSKI015示意图2
图 2转化及筛选3
图 3普通植株和巨大化的突变株4
表1T1代转基因植株统计4
真空渗入法介导的不结球白菜激活标记突变体库的构建
引言
引言
现代生物技术的成功，极大的促进了生命科学的发展。在植物上运用这些技术，使人类可以更好的改良植物的性状，便于打破种属的界限，进行基因重组和转移。各种技术体系已经建立，并取得了巨大成就。
芸薹属（Brassica）是十字花科中的一个大属，包括100多个种，其中许多是重要的农作物，是油料、蔬菜的饲草的重要来源，某些作物含有重要保性物质［1］。很长一段时间，育种专家对不结球白菜等芸薹属作物很重视，使用所有可利用的方法，改良种质和种质资源创新，取得了丰硕的成果。植物基因工程技术的应用成为了解决农业方面 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
困难的新途径。
不结球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）是十字花科芸薹属芸薹种，简称白菜，又称青菜、小白菜，食用器官为叶柄和叶片，是一年生或二年生草本植物，其种类繁多，可周年栽培周年供应，长江及以南地区多有栽培。近年来，不结球白菜被东南亚和一些欧美国家广泛应用。不结球白菜的农艺性状决定其产量及商品性，而基因决定其农艺性状［2］。随着人口的增长，改良不结球白菜的品质，提高质量，是重中之重的任务。通过对基因功能的分析与鉴定，分析其有益基因用于育种，已经发展成为一种趋势。构建不结球白菜突变体库的意义可以帮助分析不结球白菜的基因功能，还可以扩大生物的多样性，获得新的性状和类型，同时为育种工作提供了新的种质资源。所以，对其功能基因组的研究刻不容缓。本文以不结球白菜为实验材料，通过真空渗入法来侵染植株，构建了不结球白菜的激活标记突变体库，其突变体库的构建可以帮助研究重要基因的一些功能。
那么如何将目的基因导入受体植株呢？目前，农杆菌介导的基因转化是主要方法，但是都要经过外植体组织培养阶段来获得转化再生植株。然而，组织培养不仅技术要求高、人财物话费较大，还容易产生体细胞变异、形态畸形、染色体数目改变和育性丧失等各种各样的问题导致遗传背景复杂化。转化后植株的筛选工作也比较困难。因此，植物原位转基因技术逐步发展起来。本实验将采用真空渗入技术。
1 材料与方法
1.1 植物材料
本实验所用的材料为“49菜心”种子。
1.2 菌株与质粒
农杆菌菌株为GV3101,已转入激活标记载体pSKI015，如图1。
图1激活标记载体pSKI015的示意图
Fig.1 Diagram of activation tagging vector pSKI015
1.3 “49菜心”的准备
将“49菜心”种子置于4 ℃冰箱中催芽，3 d后盆栽于温室中。15到30天后，取刚抽薹的植株为材料（图2A）。植株侵染前要将其从盆里取出，将根部的泥土用清水洗净，备用。
1.4 渗入转化液的准备
农杆菌菌株为GV3101（含质粒pSKI015），挑单菌落于YEP液体培养基中（组成为酵母提取物10 g/l，蛋白胨10 g/l，氯化钠5 g/l，pH 7.0）,28 ℃下震荡培养2 d，加抗生素利福平、卡那霉素和羧苄青霉素至终浓度各为50 mg/l。按1:50的比例在新鲜的含抗生素的YEP液体培养基中扩大培养至指数生长中期（菌液OD600≈1.5)［3］。2800×g离心10 min，弃上清。将沉淀重新悬浮于转化介质，制成渗入转化工程液。
1.5 “49菜心”的转化
将整个植株放入盛有渗入转化液的真空干燥器内，全部没入转化液中，进行真空处理，到达预定的设计时间后，关闭阀门，然后关闭真空抽气机，慢慢打开真空干燥器上的阀门，待恢复常压后，取出植株，立即定植于温室。处理好的植株呈现水渍状，通体墨绿色。对使用后的转化液，应当进行高压灭菌后丢弃；器具经过氧乙酸浸泡杀毒清洗后备用；操作场地应用70％酒精杀毒［1］，如图2B。
1.5.1 转化植株的管理
不结球白菜转化后马上定值于南农实验基地，定植时将下部受损伤严重的叶片摘掉，浇水灌透。维持棚内较高的湿度，以便利于缓苗，维持高湿度非常重要。温度保持在20℃—25℃ 7到10天后根据植株的恢复情况，逐渐放风，降低湿度，锻炼转化株。观察记录T0代植株的生长状况，收集杂交后代种子。种子成熟收获，干燥后保存。其他管理按照常规技术进行。
1.5.2 转化植株的筛选
从真空转化处理的植株(T0代)上收获的种子(T1代)，播种在平底苗盘中，每盘约播种50粒种子。播种的育苗基质为草炭3:蛭石1。出苗后，常规管理，待幼苗生长到子叶完全展开，喷施2.5 ml/L的商品除草剂Basta(phosphinotricin, Hoechst AG，FRG，含PPT 150mg/L)水溶液，来筛选抗性株。非抗性株在喷药后2—3天，叶片便开始枯萎，整个植株死掉，抗性株由于有Bar基因的表达产物，能够分解PPT而除去毒性，生长照常不受影响。 5—7天后第二次喷洒除草剂Basta，以防因为出苗晚或操作不当而存在的非筛选植株，再过5—7天后第三次喷洒除草剂Basta［1］。根据以往的经验，三次筛选，可以杜绝可能存在的遗漏筛选现象。期间根据苗的大小适时移植到大的盆钵中。最后剩下的植株视为抗性株。观察、记录T1代表型。
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