水稻抽穗期基因osphyc的crisprcas9敲除载体的构建(附件)
抽穗期是决定农作物产量的关键，决定着水稻品种的生态适应性和季节适应性，与高产稳产密切相关。OsPhyc是水稻抽穗期基因之一 ，介导作物的生长发育。为进一步探讨水稻抽穗期基因OsPhyc的结构、功能和原理，本课题制备和扩增了gRNA表达盒，利用改良的Ⅱ型CRISPR系统与CRISPR/Cas9-MH载体进行连接，经大肠杆菌DH5α转化试验、质粒酶切试验验证以及测序结果比对分析，成功构建水稻OsPhyc基因的CRISPR基因敲除载体。这一载体将被用来深入开展OsPhyc基因的功能研究，为进一步研究水稻抽穗期调控机理提供重要的材料与基因资源，具有重要的研究意义。关键词 水稻，抽穗期，OsPhyc，CRISPR系统
目录
1 引言 1
1.1 CRISPR/Cas的研究背景 1
1.2 CRISPR/Cas结构与分类 2
1.3 CRISPR/Cas在水稻中的应用现状 2
1.4 水稻抽穗期基因OsPhyc的研究背景及现状 3
1.5 研究的目的与意义 3
2 材料与方法 4
2.1 实验材料 4
2.1.1 水稻材料 4
2.1.2 菌株与质粒载体 4
2.1.3 试剂耗材 4
2.1.4 引物合成及测序 4
2.2 研究方法 4
2.2.1 水稻抽穗期OsPhyc基因的生物信息学分析 4
2.2.2 CRISPR系统的靶位点设计 5
2.2.3 靶点接头的设计 6
2.2.4水稻OsPhyc基因的CRISPR/Cas9表达载体的构建 6
3 结果分析 9
3.1 水稻OsPhyc基因的序列分析 9
3.2 水稻抽穗期基因OsPhyc的CRISPR/Cas9表达载体的构建 12
3.2.1 gRNA表达盒的PCR扩增检测 12
3.2.2 菌液PCR验证 12
3.2.3 载体测序结果分析 13
结论 24
致谢 25
参 考 文 献 26
1 引言< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
br /> 基因编辑是近年发展起来的一项新的研究技术，其主要原理是利用人工核酸酶定点修饰基因组从而达到改变基因组的目的[1]。科研人员利用该项新技术，可精准定位直达目的基因的目标位点上，剪断目的DNA序列，同时对剪断的目的DNA在被细胞内的修复机制修复时实现基因的修饰（插入、敲除、替换和突变），从而达到定点改变基因组的目的[2]。
基因编辑技术具有极广泛的发展前途和无尽的应用价值。在科研方面，基因编辑技术可快速构建模式动物，节约大量时间和经费[3]; 在医学方面，该技术可以更准确深入地了解疾病发病机理，探究基因功能，改造人的基因以达到治疗的目的；在农学方面，该技术可以人为改造基因序列，使之符合人们的需求，用以改良水稻等粮食作物的品种品质。随着社会的发展，人们对基因的认知也越来越深入，科研人员完成并公布了多种动植物模式生物全基因测序的序列，这些复杂庞大的基因信息对于深入研究基因功能提供了更多的可能。
科学家们利用反向遗传学法来研究目的基因的作用：研究缺失目的基因的相应突变体可以为这个基因功能验证提供最直接有力的证据[4]。而最直接最有效的方法就是通过定点突变使目的基因完全失活[5]。近年来，随着多种人工核酸酶的出现和利用和基因编辑技术的快速发展，使目的基因的定点敲除和敲入变得更简单更高效。
1.1 CRISPR/Cas的研究背景
1987 年，Ishino 等在对大肠杆菌编码的碱性磷酸酶基因进行研究时发现，该基因编码区下游存在一段重复序列，该序列是由长度为 29 bp 的重复片段 (Repeats)和 32?33 bp 的非重复片段 (Spacers) 间隔相连的。之后的研究发现这种重复序列的结构在细菌和古细菌中广泛存在[6]。随着研究的深入，人们对该结构愈发了解，2002 年，这种结构被正式定义为Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats （CRISPR）。2012 年，Jinek 等将 CRISPR/Cas9 系统中 crRNA 和 tracrRNA 两个非编码 RNA 改造成一个RNA[7]，即单导向 RNA (Singleguide RNA, sgRNA)，它能够指导 Cas9 蛋白[8]，对目的DNA序列进行靶向断裂，为 CRISPR/Cas9 系统的普遍应用奠定了一定的基础[9]。
之后 CRISPR/Cas9 系统就被应用到真核生物中，还因此在科研界引发了一场遗传操作的革命。CRISPR/Cas9 系统只需针对 sgRNA 进行设计，实验简单、操作容易且节省时间[10]，因此，基因编辑技术已经开始被广泛运用在不同物种中。
1.2 CRISPR/Cas结构与分类
CRISPR 作为一种特殊的 重复DNA 序列，主要由多段高度保守的重复片段（长度 25?50 bp ）和 间隔片段（长度26?72 bp ）间隔串联形成。研究表明，间隔片段可能是一些入侵遗传单位在细菌内的残留，为细菌提供某种抵制外源DNA 的特异性免疫基因。在该结构的上游是前导序列 (Leader) 和一系列 CRISPR 相关蛋白基因 ，它们共同组成了 CRISPR基因序列[11]，如图 。
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图1 CRISPR位点结构图
根据适应阶段的高度保守性及表达和干扰阶段的差异性，人们将 CRISPR系统分为 3 大类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。在这3类CRISPR/Cas系统中，Ⅱ型系统的核糖核蛋白复合物相对简单，除crRNA和tracrRNA外，只有一个Cas9蛋白[12]。而目 前 也是以 Ⅱ 型 CRISPR 系 统 为 基 础 的CRISPR/Cas9 系统在基因组编辑中的应用较为广泛。
1.3 CRISPR/Cas在水稻中的应用现状
水稻是人的主要粮食作物，维持了世界约一半的人口生活，因此研究CRISPR/Cas在水稻中的作用具有重要意义。随着近几年CRISPR/Cas9系统在水稻中应用的报道相继出现，为CRISPR/Cas9系统在水稻中的稳定应用及进一步应用该技术提高水稻的产量，抗性及品质等提供了理论基础[13]。
CRISPR/Cas9可创造出优良的育种材料，在基因功能中发挥作用。例如，会使水稻对苯达松和磺酰脲类除草剂失去抗性的苯达松敏感致死基因功能的缺失[14]。Xu等将2个35S启动子驱动植物密码子优化的pSpCAS9和拟南芥U626启动子驱动的，以水稻BEL为靶标的sgRNA整合于一个表达载体中, 通过农杆菌侵染转化水稻胚性愈伤, 获得了90条独立的转基因株系， 发现其中有14条株系发生基因的改变, 部分是纯合突变植株, 并表现出对苯达松除草剂敏感的表型, 为防止杂交育种污染和拓宽杂交水稻的亲本材料提供了新的途径[15]。这些研究报告充分表明, CRISPR/Cas9基因编辑技术可以对水稻基因成功进行编辑, 不仅在阐明基因功能方面, 而且在改良水稻品种方面具有良好的应用前景。
目录
1 引言 1
1.1 CRISPR/Cas的研究背景 1
1.2 CRISPR/Cas结构与分类 2
1.3 CRISPR/Cas在水稻中的应用现状 2
1.4 水稻抽穗期基因OsPhyc的研究背景及现状 3
1.5 研究的目的与意义 3
2 材料与方法 4
2.1 实验材料 4
2.1.1 水稻材料 4
2.1.2 菌株与质粒载体 4
2.1.3 试剂耗材 4
2.1.4 引物合成及测序 4
2.2 研究方法 4
2.2.1 水稻抽穗期OsPhyc基因的生物信息学分析 4
2.2.2 CRISPR系统的靶位点设计 5
2.2.3 靶点接头的设计 6
2.2.4水稻OsPhyc基因的CRISPR/Cas9表达载体的构建 6
3 结果分析 9
3.1 水稻OsPhyc基因的序列分析 9
3.2 水稻抽穗期基因OsPhyc的CRISPR/Cas9表达载体的构建 12
3.2.1 gRNA表达盒的PCR扩增检测 12
3.2.2 菌液PCR验证 12
3.2.3 载体测序结果分析 13
结论 24
致谢 25
参 考 文 献 26
1 引言< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
br /> 基因编辑是近年发展起来的一项新的研究技术，其主要原理是利用人工核酸酶定点修饰基因组从而达到改变基因组的目的[1]。科研人员利用该项新技术，可精准定位直达目的基因的目标位点上，剪断目的DNA序列，同时对剪断的目的DNA在被细胞内的修复机制修复时实现基因的修饰（插入、敲除、替换和突变），从而达到定点改变基因组的目的[2]。
基因编辑技术具有极广泛的发展前途和无尽的应用价值。在科研方面，基因编辑技术可快速构建模式动物，节约大量时间和经费[3]; 在医学方面，该技术可以更准确深入地了解疾病发病机理，探究基因功能，改造人的基因以达到治疗的目的；在农学方面，该技术可以人为改造基因序列，使之符合人们的需求，用以改良水稻等粮食作物的品种品质。随着社会的发展，人们对基因的认知也越来越深入，科研人员完成并公布了多种动植物模式生物全基因测序的序列，这些复杂庞大的基因信息对于深入研究基因功能提供了更多的可能。
科学家们利用反向遗传学法来研究目的基因的作用：研究缺失目的基因的相应突变体可以为这个基因功能验证提供最直接有力的证据[4]。而最直接最有效的方法就是通过定点突变使目的基因完全失活[5]。近年来，随着多种人工核酸酶的出现和利用和基因编辑技术的快速发展，使目的基因的定点敲除和敲入变得更简单更高效。
1.1 CRISPR/Cas的研究背景
1987 年，Ishino 等在对大肠杆菌编码的碱性磷酸酶基因进行研究时发现，该基因编码区下游存在一段重复序列，该序列是由长度为 29 bp 的重复片段 (Repeats)和 32?33 bp 的非重复片段 (Spacers) 间隔相连的。之后的研究发现这种重复序列的结构在细菌和古细菌中广泛存在[6]。随着研究的深入，人们对该结构愈发了解，2002 年，这种结构被正式定义为Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats （CRISPR）。2012 年，Jinek 等将 CRISPR/Cas9 系统中 crRNA 和 tracrRNA 两个非编码 RNA 改造成一个RNA[7]，即单导向 RNA (Singleguide RNA, sgRNA)，它能够指导 Cas9 蛋白[8]，对目的DNA序列进行靶向断裂，为 CRISPR/Cas9 系统的普遍应用奠定了一定的基础[9]。
之后 CRISPR/Cas9 系统就被应用到真核生物中，还因此在科研界引发了一场遗传操作的革命。CRISPR/Cas9 系统只需针对 sgRNA 进行设计，实验简单、操作容易且节省时间[10]，因此，基因编辑技术已经开始被广泛运用在不同物种中。
1.2 CRISPR/Cas结构与分类
CRISPR 作为一种特殊的 重复DNA 序列，主要由多段高度保守的重复片段（长度 25?50 bp ）和 间隔片段（长度26?72 bp ）间隔串联形成。研究表明，间隔片段可能是一些入侵遗传单位在细菌内的残留，为细菌提供某种抵制外源DNA 的特异性免疫基因。在该结构的上游是前导序列 (Leader) 和一系列 CRISPR 相关蛋白基因 ，它们共同组成了 CRISPR基因序列[11]，如图 。
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图1 CRISPR位点结构图
根据适应阶段的高度保守性及表达和干扰阶段的差异性，人们将 CRISPR系统分为 3 大类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。在这3类CRISPR/Cas系统中，Ⅱ型系统的核糖核蛋白复合物相对简单，除crRNA和tracrRNA外，只有一个Cas9蛋白[12]。而目 前 也是以 Ⅱ 型 CRISPR 系 统 为 基 础 的CRISPR/Cas9 系统在基因组编辑中的应用较为广泛。
1.3 CRISPR/Cas在水稻中的应用现状
水稻是人的主要粮食作物，维持了世界约一半的人口生活，因此研究CRISPR/Cas在水稻中的作用具有重要意义。随着近几年CRISPR/Cas9系统在水稻中应用的报道相继出现，为CRISPR/Cas9系统在水稻中的稳定应用及进一步应用该技术提高水稻的产量，抗性及品质等提供了理论基础[13]。
CRISPR/Cas9可创造出优良的育种材料，在基因功能中发挥作用。例如，会使水稻对苯达松和磺酰脲类除草剂失去抗性的苯达松敏感致死基因功能的缺失[14]。Xu等将2个35S启动子驱动植物密码子优化的pSpCAS9和拟南芥U626启动子驱动的，以水稻BEL为靶标的sgRNA整合于一个表达载体中, 通过农杆菌侵染转化水稻胚性愈伤, 获得了90条独立的转基因株系， 发现其中有14条株系发生基因的改变, 部分是纯合突变植株, 并表现出对苯达松除草剂敏感的表型, 为防止杂交育种污染和拓宽杂交水稻的亲本材料提供了新的途径[15]。这些研究报告充分表明, CRISPR/Cas9基因编辑技术可以对水稻基因成功进行编辑, 不仅在阐明基因功能方面, 而且在改良水稻品种方面具有良好的应用前景。
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